UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS

1. UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells Francisco J. Iborra, Dean A. Jackson, Peter R. Cook Science vol 293, 1139-1142 Agosto 2001

2. Introdução Procariotos X Eucariotos RNA pol RNA pol DNA DNA mRNA Transcrição Transcrição mRNA Ribossomos Citoplasma Núcleo Transporte Citoplasma mRNA maduro mRNA degradado Citoplasma Tradução Ribossomo Tradução

3. Introdução A membrana nuclear é a característica que define os eucariotos.  Ela divide a célula em dois compartimentos e assume-se que a tradução está restrita somente a um deles - o citoplasma.  A idéia seria EVITAR a tradução antes do splicing.

4. Introdução Três evidências para que ocorra tradução no núcleo: 1. Núcleo contém componentes necessários, mas estes podem não estar ativos;

5. Introdução 2. Experimentos “pouco” controlados levam a acreditar que núcleos podem aminoacilar tRNAs e incorporar aminoácidos radioativos em proteínas. Suspeita de contaminação Migração Proteínas Citoplasma Núcleo

6. Introdução 3. Degradação dos transcritos que possuem stopcódons prematuros (fenômeno conhecido como “nonsense-mediated decay” - NMD). Stop códon prematuro Degradação UAA mRNA mRNA

7. Introdução  Como pode a única maquinaria capaz de reconhecer um stop códon - um ribossomo citoplasmático ativo - disparar a degradação de um transcrito que ainda está no núcleo?

8. Metodologia Antiga  Metodologia antiga de localização de sítios de tradução no núcleo: [ 3H ] leucina tRNAleu - [ 3H ] leucina. Proteína  Desvantagem: tempo de incubação longo para a conversão da [ 3H ] leucina o que dá tempo à proteína recém sintetizada de entrar no núcleo. Conversão Síntese

9. Metodologia Atual  Um sistema de tradução in vitro que utilizasse temperatura baixa e concentrações subótimas de precursores, de modo que poucas proteínas, que continham em média 350 resíduos de aminoácidos, fossem completadas durante a reação e estivessem aptas a escapar dos sítios de síntese.

10. Metodologia Atual  Materiais a serem utilizados: Mg2+ [ 3H ] leu HCO3- GTP K+ ATP Na+ Aminoacil tRNA sintetases 19 aa

11. Metodologia Atual  Condições do experimento:  Incubação a baixas temperaturas, 27.5o  Curto tempo, 3 minutos  Consequentemente, poucas proteínas seriam completadas durante a incubação.  Somente 15 resíduos seriam polimerizados.  Tamanho médio das proteínas seria de ~350aa.

12. Padronização do sistema  Verificação do efeito de inibidores na incorporação de [ 3H ] lisina durante a síntese de proteínas. 9%

13. Padronização do sistema  A mesma verificação foi feita ao se incorporar [35S] Met durante a síntese protéica.  Produtos marcados tinham o tamanho esperado de uma população de polipeptídeos recém-sintetizados normais.

14. Padronização do sistema  Para garantir, verificaram que a incorporação de [3H] Leu na presença de biotina-lisina-tRNA não inibia a síntese de proteínas.  Além disso, viram que a biotina era melhor imunolocalizador que os precursores radioativos.

15. Imunolocalização da biotina A imunolocalização de polipeptídeos recém-sintetizados com biotina é complicada pela existência de biotina endógena.  Esta é encontrada solúvel e/ou covalentemente ligada a carboxilases na matriz mitocondrial.  A biotina solúvel foi extraída utilizando-se tRNAs carregados. E a biotina covalentemente ligada foi imunomarcada.

16. Imunolocalização da biotina Biotina nas mitocôndrias foi prontamente detectada, mas a dos núcleos não. Núcleo e citoplasma mais marcados após incubação com biotina-lisina-tRNA. A marcação nuclear está concentrada em sítios discretos. Controle com cicloheximida reduziu a marcação porque inibe a síntese protéica.

17. Imunolocalização da biotina  Alguns peptídeos com biotina poderiam ter sido feitos no citoplasma e importados para dentro do núcleo, mas marcação similar foi obtida com núcleos isolados desprovidos de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos. Célula X Núcleo

18. Imunolocalização da biotina  Nenhum sinal mitocondrial foi visto do lado de fora dos núcleos, confirmando que a maior parte do citoplasma havia sido removida.  A remoção de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos não afetou a intensidade nuclear.

19. Imunolocalização da biotina A periferia nuclear não foi marcada, por isso, a síntese de proteínas na membrana nuclear externa seguida por importação não foi a responsável pela marcação interna.  A mesma intensidade nucleoplasmática foi obtida em amostras de células e núcleos isolados.

20. Imunolocalização da biotina Células 50 Núcleo 25 Número 0 0 40 80 Intensidade ( unidade arbitrária)

21. Imunolocalização da biotina  Para provar que ribossomos citoplasmáticos não eram os responsáveis pela marcação do núcleo, foi utilizada a droga “thapsigargin” (bloqueador de importaçãonuclear). Proteínas > 40KDa Núcleo + thapsigargin

22. Imunolocalização da biotina  Mesmo que os ribossomos citoplasmáticos tivessem entrado, eles não poderiam iniciar a tradução porque foi adicionado ATA (ácido aurintricarboxílico). Este inibe o início da tradução sem afetar a marcação do nucleoplasma.  Todos estes controles serviram para confirmar que a tradução citoplasmática não poderia ser considerada na marcação nuclear.

23. BODIPY-lisina-tRNA  Resultados similares foram obtidos com BODIPY-lisina -tRNA que também marca proteínas recém-sintetizadas em reações de tradução.  BODIPY-lisina -tRNA não tem o imprevisto da biotina, pois não é um composto endógeno.

24. BODIPY-lisina-tRNA Células permeabilizadas Células permeabilizadas + cicloheximida

25. BODIPY-lisina-tRNA O sinal nucleoplasmático constitui 14% do total. A marcação citoplasmática foi cerca de 5 vezes mais forte que a nuclear. Núcleo mRNA Citoplasma mRNA

26. Biotina X BODIPY-lisina-tRNA  A marcação com biotina-lisina-tRNA e BODIPY-lisina-tRNA, que foi detectada com métodos diferentes, deram resultados similares.

27. Biotina X BODIPY-lisina-tRNA 100% Biotina-lisina-tRNA 15% BODIPY-lisina-tRNA

28. Immunogold  Posteriormente, células permeabilizadas e incubadas com biotina-lisina-tRNA foram marcadas com “Immunogold” confirmando que o interior nuclear continha cerca de 10% dos peptídeos recém-sintetizados da célula.

29. Immunogold Citoplasma Núcleo

30. Immunogold  Hipótese: - Se toda a tradução ocorresse no citoplasma, proteínas recém-sintetizadas entrariam e se difundiriam por todo o núcleo; mas, se alguma tradução estivesse unida à transcrição alguns peptídeos nascentes teriam que ser encontrados juntamente com transcritos nascentes.

31. Immunogold  Polipeptídeos recém-sintetizados e RNA foram estendidos na presença de biotina-lisina-tRNA e Br-UTP e também marcados com “Immunogold”. Os dois foram, muitas vezes, encontrados juntos.

32. Resultado final  Mostrou-se que : - lisina ligada a três diferentes marcadores - 3H, biotina e BODIPY - é incorporada dentro de sítios discretos no núcleo e que alguma desta tradução nuclear depende de transcrição simultânea pela RNA polimerase II.

33. Modelo  A partir deste resultado combinado ao resultado obtido no NMD propõe-se o seguinte modelo: - Ribossomos são montados dentro do nucléolo e exportados para ambos nucleoplasma e citoplasma, onde eles se associarão com transcritos e se tornarão ativos; - Exportação não precisa ser seletiva, talvez 10 vezes mais ribossomos terminem ativos no citoplasma, enquanto o nucleoplasma está junto à cromatina.

34. Modelo - Alguns ribossomos nucleares estão incorporados dentro dos sítios de transcrição do nucleoplasma que contêm muitas polimerases ativas e unidades de transcrição. - Estes ribossomos “corrigem” transcritos recém-sintetizados enquanto eles emergem de polimerases.

35. Modelo - Qualquer ribossomo acoplado detecta stop códons incorretamente posicionados, ativando a degradação destes transcritos; simultaneamente polipeptídeos truncados e indesejáveis são degradados por proteasomas. - Se nenhum stop códon prematuro for encontrado, o transcrito deverá ser exportado para o citoplasma onde sofrerá múltiplas iniciações.

36. Conclusão Geral Isto leva a crer que os precursores de transcrição e tradução eucarióticos estão unidos, tanto quanto em procariotos.