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ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

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ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO - PowerPoint PPT Presentation


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ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO. Definizione. CITO FLUORI METRIA o CITOMETRIA A FLUSSO. Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche

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Presentation Transcript
definizione
Definizione

CITOFLUORIMETRIAo CITOMETRIA A FLUSSO

Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse

misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche

all’interno di un flusso laminare

che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita

principi di funzionamento
Principi di funzionamento
  • Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica)
  • Sistema ottico (laser Argon 488nm)
  • Sistema elettronico (software CellQuest)
parametri
Parametri
  • LIGHT SCATTERING

(Forward and Side Scatter)

  • FLUORESCENZA

(FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC, ...)

light scattering
Light Scattering

Sangue periferico

fluorescenza
Fluorescenza

IMMUNOFLUORESCENZA

DIRETTA

Plot FITC/PE/Per CP

Intensita’ F proporzionale ai siti di legame

marcatori linfocitari la nomenclatura cd
Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD

Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che:

  • identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo
  • ha una struttura biochimica definita
  • è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi
informazioni aggiornate

Informazioni aggiornate

www.courseware.vt.edu/users/kdelgert/ (www.bsi.vt.edu/immunology)

www.ncbi.nlm.nih.gov/prow

applicazioni
Applicazioni
  • determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari
  • valutazione del contenuto cellulare di DNA
  • discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche
  • predisposizione per la separazione cellulare
immunofenotipo
Immunofenotipo

Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti

in caso di antigenti specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi

e malattia residua minima

marcatori b lineage

TdT

CD79a

CD19

CD10

CD20

CD22

Cu

SmIg

Marcatori B-lineage

marcatori t lineage

CD7

CD2

CD5

CD3

CD1

CD4

CD8

TdT

TCR

Marcatori T-lineage

marcatori granulocitopoiesi

CD34

CD13

CD33

CD117

CD11b

CD16

CD66b

CD66c

CD15

Marcatori granulocitopoiesi

marcatori monocitopoiesi

CD34

CD13

CD33

CD14

CD11b

CD16

CD66b

CD66c

CD15

Marcatori monocitopoiesi

marcatori eritrocitopoiesi

Marcatori eritrocitopoiesi

CD34

CD45

CD33

CD71

CD105

CD36

GPA

gating cd 45
GatingCD 45

ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

espressione cd45
Espressione CD45

Linfociti

Monociti

Granulociti maturi

Cellule immature

Granulociti immaturi

Eritrociti

scelta degli antigeni e criteri di positivit

Scelta degli antigeni e Criteri di Positività

ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B)

ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133)

Positività?

all t1
ALL-T

CD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT ,(CD34)

all b common1
ALL-B, common

CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15)

all b b matura1
ALL-B, B matura

CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT

slide30
LAP

MPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR, CD41, CD56, CD61 (CD2)

slide31
LAP

G+15 dopo terapia con ATRA

ESORDIO:popolazione blastica

G+15:popolazione matura

dati ricerca

DATI RICERCA

  • Differenziamento

Pession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene. 2003 Nov 27;22(54):8671-6.

Ciclo cellulare e apoptosi

Pession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72.

vantaggi dell analisi citofluorimetrica
VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica :
  • multiparametricità
  • possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula
  • analisi di grandi quantità di cellule
  • riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni
  • grande sensibilità
  • rapidità di analisi
  • possibilità di ulteriori analisi a posteriori
conclusioni
Conclusioni

La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi emato-oncologica :

  • Identifica la malattia residua minima
  • Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione del midollo
  • Determina la presenza di malattia disseminata

(ALL latente, santuari exramidollari)