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CITOGENETICA E APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE

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CITOGENETICA E APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE - PowerPoint PPT Presentation


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CITOGENETICA E APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE. La citogenetica classica e molecolare è associata alla diagnostica Morfologica, Fenotipica. Le malattie ematologiche nelle quali si realizza routinariamente sono sempre più numerose. Serravalle Salvatore. L’ESAME EMOCROMOCITOMETRICO.

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Presentation Transcript
citogenetica e applicazioni diagnostiche
CITOGENETICA E APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE
  • La citogenetica classica e molecolare è associata alla diagnostica Morfologica, Fenotipica.
  • Le malattie ematologiche nelle quali si realizza routinariamente sono sempre più numerose.

Serravalle Salvatore

slide2

L’ESAME

EMOCROMOCITOMETRICO

Nel midollo esistono due grandi categorie (o serie ) di cellule:

la linfoide (che comprende un tipo di globuli bianchi, i linfociti, e le plasmacellule che da essi originano) e la mieloide ( detta anche non linfoide) che comprende in pratica tutti gli altri tipi di cellule (globuli rossi, globuli bianchi, piastrine e loro precursori).

Le cellule più immature di entrambe le serie vengono chiamate blasti ed in condizioni normali sono meno del 5% di tutte le cellule midollari.

slide3

Rappresentazione schematica della cascata differenziativa.

Tutte le cellule del sangue si originano nel midollo osseo da una popolazione di cellule staminali pluripotenti che, differenziandosi, seguono una definita cascata differenziativa:

la neoplasia può insorgere in una delle diverse fasi della via di maturazione linfoide o mieloide.

slide4

DEFINIZIONE

  • A.Se la trasformazione tumorale riguarda i blasti
  • della serie linfoide si parla di leucemialinfoblasticaacuta (ALL);
  • B.Negli altri casi si parla di leucemia mieloideacuta
  • (AML);
  • altri sinonimi per questa malattia sono leucemia mieloblastica acuta(AML)
  • onon linfoblastica acuta(ANLL) Nelle leucemie acute i blasti midollari sono in genere superiori al 30%.
slide5
CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE NEOPLASTICHEDEL TESSUTO EMOPOIETICO E LINFOIDEWorld Health Organization - 1997

NEOPLASIE MIELOIDI

Malattie mieloproliferative

Leucemia Mieloide Cronica, cromosoma Philadelphia positiva [t(9;22)(q34;q11), bcr/abl]

Leucemia cronica neutrofilica

Leucemia cronica eosinofilica / sindrome ipereosinofila

MieloFibrosi Idiopatica cronica

Policitemia Vera

Trombocitemia Essenziale

Malattia mieloproliferativa non classificata

Malattie mielodisplastiche / mieloproliferative

Leucemia MieloMonocitica Cronica

Leucemia mieloide cronica atipica

Leucemia mielomonocitica giovanile

Sindromi mielodisplastiche

Anemia Refrattaria

con sideroblasti ad anello

senza sideroblasti ad anello

Citopenia refrattaria (sindrome mielodisplastica)

con displasia multilineare

Anemia Refrattaria (sindrome mielodisplastica)

con Eccesso di Blasti

Sindrome 5q-

Sindrome MieloDisplastica non classificata

Leucemie Acute Mieloidi

LAM con traslocazioni citogenetiche ricorrenti:

LAM con t(8;21)(q22;q22), aml1(cbfa )/eto

LA Promielocitica [LAM con t(15;17)(q22;q21) e var, pml/rara]

LAM con eos. mid. [inv(16)(p13;q22) o t(16;16), cbfb/myh11]

LAM con anomalie 11q23 (mll)

LAM con displasia multilineare

con precedente sindrome mielodisplastica

senza precedente sindrome mielodisplastica

LAM e sindromi mielodisplastiche correlate a terapie

correlate ad agenti alchilanti

correlate a epipodofillotossine

altri tipi

LAM non altrimenti classificate

LAM scarsamente differenziata, M0

LAM senza maturazione, M1

LAM con maturazione, M2

LA promielocitica, M3

LA mielomonocitica, M4

LA monocitica, M5

LA eritroide, M6

LA megacariocitica, M7

LA basofilica

Panmielosi acuta con mielofibrosi

Leucemie acute bifenotipiche

slide6
CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE NEOPLASTICHEDEL TESSUTO EMOPOIETICO E LINFOIDEWorld Health Organization - 1997

NEOPLASIE LINFOIDI

Neoplasie delle cellule B

Neoplasie dei precursori B

Leucemia / linfoma B linfoblastica (Leucemia Acuta Linfoblastica B)

Neoplasie delle cellule B mature (periferiche)

Leucemia Linfocitica Cronica B / linfoma a piccoli linfociti B

Leucemia prolinfocitica B

Linfoma linfoplasmocitico

Linfoma splenico B delle zona marginale (+/- linfociti villosi)

Leucemia a cellule capellute

Mieloma a plasmacellule / plasmocitoma

Linfoma extranodale B delle zona marginale di tipo MALT

Linfoma nodale B delle zona marginale (+/- cellule B monocitoidi)

Linfoma Follicolare

Linfoma a cellule Mantellari

Linfoma Diffuso a Grandi Cellule B

linfoma a grandi cellule B del mediastino

linfoma primary effusion

Linfoma di Burkitt / leucemia a cellule di Burkitt

Neoplasie delle cellule T e NK

Neoplasie dei precursori T

Leucemia / linfoma T linfoblastica (Leucemia Acuta Linfoblastica T)

Neoplasie delle cellule T mature (periferiche)

Leucemia prolinfocitica T

Leucemia linfocitica T granulare

Leucemia a cellule NK aggressive

Linfoma / leucemia T dell’adulto (HTLV1+)

Linfoma extranodale NK/T, tipo nasale

Linfoma T, tipo enteropatia

Linfoma T epatosplenico gamma-delta

Linfoma T sottocutaneo tipo panniculite

Micosi Fungoide / Sindrome di Sezary

Linfoma anaplastico a grandi cellule, T / null, tipo primitivo cutaneo

Linfoma a grandi cellule T periferiche, non altrimenti classificato

Linfoma T angioimmunoblastico

Linfoma anaplastico a grandi cellule, T / null, tipo primitivo sistemico

Linfoma di Hodgkin (LH)

DISORDINI LINFOPROLIFERATIVI POST-TRAPIANTO (PTLD)

NEOPLASIE DELLE MAST CELLULE

NEOPLASIE DELLE CELLULE ISTIOCITICHE E DENDRITICHE

slide7

Leucemie acute linfoblastiche (ALL) 70%

Leucemie acute non linfoblastiche (AML) 30-40%

Leucemie mieloidi croniche (LMC) 3%

Leucemie linfocitiche croniche (CLL) rare

Relazioni evidenti tra INSORGENZA MALATTIA e PRESENZA di ALTERAZIONI CROMOSOMICHE

 sono coinvolti

Geni per fattori di trascrizione

Anomalie regolazione del sistema emopoietico e dei processi apoptotici

geni coinvolti nei tumori
Geni coinvolti nei tumori

GENI MUTATORI:responsabili del mantenimento dell’integrita’ del genoma durante le replicazione cellulare.

ONCOGENI: geni la cui azione promuove positivamente la proliferazione cellulare.

ONCOSOPPRESSORI (TS): i prodotti di tali geni inibiscono la proliferazione cellulare.

slide9

Geni di Fusione

  • Si definiscono geni di fusione gli oncogeni associati a traslocazioni cromosomiche specifiche, generati dalla ricombinazione tra due geni.
  • Danno origine a m-RNA chimerici il cui prodotto e’ espresso ed e’ neoplastico se entrambi i due oncogeni sono funzionanti.
  • Un tipico esempio e’ l’oncogene PML-RAR alfa associato alla t(15;17) ed alla Leucemia Acuta a promielociti.
cellule normali e cancerose
Cellule normali e cancerose

CELLULE NORMALI

CELLULE CANCEROSE

  • INIBIZIONE

DA CONTATTO

  • PERDITA INIBIZIONE

DA CONTATTO

  • INCAPACI DI CRESCERE IN SOSPENSIONE
  • (ECCEZIONE I LINFOCITI)
  • CRESCONO IN SOSPENSIONE
  • DIPENDENTI DAI FATTORI DI CRESCITA
  • INDIPENDENTI DA FATTORI DI CRESCITA
  • MORTALI
  • IMMORTALI
slide12

5 avvolgimenti

2nm

della doppia elica

sezione della

11nm

cromatina

fibra di 30nm con

i

nucleosomi

30nm

strettamente

impacchettati

parte di una sezione

300nm

di cromosoma

sezione condensata

700nm

di un cromosoma

metafasico

1400nm

cromosoma

metafasico

CITOGENETICA :

Processo di analisi che valuta il numero e la forma dei cromosomi.

Le cellule umane contengono 46 cromosomi.

I geni, cioè frammenti specifici di DNA, sono i principali costituenti dei cromosomi.

In un singolo cromosoma sono mediamente presenti 2.000 geni.

I cromosomi X e Y, sono quelli che

determinano il sesso:

Nella donna sono presenti due cromosomi X,e nell’uomo un X e un Y.

slide14

Lunghezza del

cromosoma

Costituenti del cromosoma

TELOMERO

COSTRIZIONE SECONDARIA

CENTROMERO

(COSTRIZIONE PRIMARIA)

p

TELOMERO

q

CARIOTIPO

Il cariotipo si esegue sull’immagine dei 46 cromosomi ottenuta mediante

fotografia o immagine computerizzata.

Costituita da 22 coppie appaiate, nelle quali uno dei cromosomi è di origine paterna ed una di origine materna.

Sono distinti a seconda della lunghezza (dal più lungo al più corto) ed in base

alle caratteristiche morfologiche (visibile con la tecnica del “bandeggio”).

I cromosomi del sesso (XX o XY) vengono evidenziati come coppia separata.

slide15

Lab.Oncoematologia

pediatrica (BO)

CARIOGRAMMA BASATO SULLA LUNGHEZZA CROMOSOMICA

E SULLA POSIZIONE DEL CENTROMERO

METAFSE

METAFASE CON NUCLEO IN INTERFASE

slide16

GRUPPO

CROMOSOMI

CARATTERISTICHE

A

1, 2, 3

Cromosomi grandi con centromeri in posizione mediana.

B

4, 5

Cromosomi grandi con centromeri sub-mediani.

C

6, 7, 8, 9, 10,11,12

Cromosomi di media grandezza con centromeri sub-mediani

D

13, 14, 15

Cromosomi di media grandezza con centromeri terminali.

E

16, 17, 18

Cromosomi piccoli con centromeri mediani e sub-mediani.

F

19, 20

Cromosomi piccoli con centromeri mediani.

G

21, 22

Cromosomi molto piccoli e acrocentrici.

slide17

BANDEGGIAMENTOCROMOSOMICO

Lo sviluppo del bandeggiamento (Caspersson, 1968 ) ha costituito un progresso decisivo per le analisi citogenetiche e ha permesso di individuare singoli cromosomi.

Vari trattamenti denaturanti consentono di colorare cromosomi, modo riproducibili

secondo una sequenza di bande chiare e scure.

Il numero del cromosoma è seguito da p (braccio corto) o q (braccio lungo) e dal numero della banda, esempio 11q23 significa, l’estremità del braccio lungo q del cromosoma 11, banda 2 sottobanda 3.

.

slide18

Cariotipo Convenzionale

(CC)

Aspirato midollare

(sangue periferico)

Colorazione (bandeggio)

Conteggio nucleate

Selezione e cattura immagini

Semina in terreno

Elaborazione e cariotipizzazione

Coltura per 24 - 72 h

Colchicina

Fissazione e lavaggi

Allestimento dei vetrini

Conclusione diagnostica

slide19

Lab.Oncoematologia

pediatrica (BO)

  • Bandeggio GTG (G-Trypsin-Giemsa):
  • E’ uno dei bandeggi più largamente utilizzati. Consiste nel trattare i cromosomi con un enzima proteolitico, la tripsina, che digerisce le proteine istoniche.
  • - In seguito si immergono i vetrini in una soluzione di Giemsa, una miscela di azur II ed azur II eosina, e questo consente la visualizzazione delle bande cosiddette G.

METAFASE DA ORDINARE

slide20

Lab.Oncoematologia

pediatrica (BO)

CARIOTIPO COSTITUZIONALE: METAFASE ORDINATA

La standardizzazione internazionale della nomenclatura dei cromosomi umani del 1981 aggiornata nel 1995 (ISCN 1995) identifica ciascuna banda e sottobanda cromosomica in 400, 550 ed 850 bande.

slide21

Bandeggio QFQ (Q-Fluorescence-Quinacrine):

  • Il bandeggio Q-Fluorescence-Quinacrine è costituito da una colorazione fluorescente.
  • E’analogo a quello G.
  • Il contrasto inoltre è inferiore a quello ottenibile con il bandeggio G (Gravholt and Friedrich 1995).

Alterazioni:

2p-

5q-

11q+

Lo svantaggio di questa tecnica deriva

dal fatto che la fluorescenza decade

rapidamente per cui il bandeggio è temporaneo.

slide22

Bandeggio CBG (C-Barium-Giemsa):

-Questa tecnica prevede un processo di denaturazione e rinaturazione grazie all'impiego di idrossido di bario, seguita dalla colorazione con Giemsa.

- Permette di mettere in evidenza tutte le regioni centromeriche.

slide23

Quali sono le anomalie cromosomiche

Di numero

trisomie

monosomie

triploidie

tetraploidie

Di struttura

traslocazioni

inversioni

delezioni

duplicazioni

slide24

anomalie cromosomiche di numero

ESEMPIO di TRISOMIA

Cromosoma 21

slide25

Trisomia 13

Sindrome Patau

anomalie cromosomiche di numero

ESEMPIO di TRISOMIA

Trisomia 18

Sindrome Edward

slide26

MONOSOMIA 22

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

slide28

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

TETRAPLOIDIA

slide30

Traslocazioni cromosomiche

I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di trascrizione, ma anche tirosin o serin protein chinasi, recettori di membrana cellulare, fattori di crescita, con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo cellulare

slide31

Traslocazioni cromosomiche

  • Deregolazione dell’espressione genica:
  • overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene.
  • Espressione di una proteina di fusione:
  • giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomi
leucemia acuta mieloide fab m2
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)

Nelle leucemie acute mieloblastiche, la traslocazione t(8;21) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida.

slide33

Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA

t(15;17)(q22;q21)

La traslocazione t(15;17) coinvolge il gene che codifica per il recettore nucleare a dell'acido retinoico (RAR) sul cromosoma 17, ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15.

VARIANTI

  • t(11;17)(q23;q22) PLZF-RARα;
  • t(5;17)(q35;q21) NPM-RARα;
  • t(11;17)(q13;q21) NuMA-RARα;
  • t(17;17)(q11;q21) STAT5b-RARα;
slide35

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

CARIOTIPO COMPLESSO : Atassia Telangectasia

slide37

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

INTERRUZIONE CROMATINA CROMOSOMA 2 BRACCIO p

slide38

CROMOSOMA DICENTRICO

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

MONOSOMIA 22

La citogenetica classica permette di avere una visione globale del cariotipo e fornisce gli spunti per ulteriori studi mirati e più approfonditi tramite FISH.

slide40

Cariotipo Convenzionale

Ibridazione in Situ

(CC)

(FISH)

Aspirato midollare

(sangue periferico)

Scelta delle sonde

Colorazione (bandeggio)

Conteggio nucleate

Denaturazione e

Ibridazione over night

Selezione e cattura immagini

Semina in terreno

Lavaggi e

controcolorazione

Elaborazione e cariotipizzazione

Coltura per 24 - 72 h

Valutazione immagini

Colchicina

Cattura / elaborazione

Fissazione e lavaggi

Allestimento dei vetrini

Conclusione diagnostica

Conclusione diagnostica

slide41

La Citogenetica Molecolare

FISH

Permette un’analisi

mirata di una regione

cromosomica

consentendo di

mettere in evidenza

riarrangiamenti di

alcune centinaia di

chilobasi.

Tale identificazione avviene mediante sonde marcate impiegando fluorocromi che

emettono a diverse lunghezze d’onda.

slide42

SONDE:

-  Sonde locus-specifiche:sono sonde molto piccole che riconoscono porzioni corte del cromosoma; vengono utilizzate per evidenziare aberrazioni che coinvolgono un gene o una parte di esso.

-  Sonde chromosome painting:riconoscono sequenze specifiche per ogni singolo cromosoma localizzate lungo tutto il suo asse; il cromosoma appare interamente colorato.

-  Sonde centromeriche (o alfoidi):riconoscono brevi sequenze centromeriche di DNA altamente ripetitive, specifiche per ciascun cromosoma. Tali sonde, che generano un segnale intenso.

- Sonde telomeriche:sono utili nell'identificazione di traslocazioni che coinvolgono le regioni telomeriche.

slide43

Metafase e Interfase normale

Metafase Traslocata

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

SONDA (LSI) DOPPIO COLORE PER t(PML /RAR )

DESCRIZIONE

METAFASE e INTERFASE NORMALI, MOSTRANO: 4 SEGNALI

DUE VERDI (RARA regione 17q21,1)

DUE ROSSI (PML regine 15q22).

METAFASE TRASLOCATA, MOSTRA: UN SEGNALE VERDE (RARA) UNO ROSSO (PML) e UN SENALE DI FUSIONE DEI DUE GENI GIALLO/BIANCO (PML-RARA)

l a m m 4 leucemia acuta mielomonocitica con eosinofili

Locus CBF e relativa sonda

Risultato atteso

patologico

.

.

.

.

.

.

.

.

normale

Risultato effettivo

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

L.A.M. M.4(Leucemia Acuta Mielomonocitica con eosinofili)
slide45

LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE(FAB M5)

  • ANOMALIE DELLA BANDA CROMOSOMICA 11q23 CON RIARRANGIAMENTI DEL GENEMLL

IL GENE MLL (Myeloid/Lymphoid Leukemia), noto anche come ALL1 (Acute Lymphoblastic Leukemia) oppure HRX (per l’omologia con il gene Trithorax della Drosofila)

  • I RIARRANGIAMENTI DI QUESTO GENE SONO STATI
  • TROVATI INDISCRIMINATAMENTE IN:
  • LEUCEMIE LINFOBLASTICHE ACUTE (LAL),
  • LEUCEMIE MIELOIDI ACUTE (LAM)
  • LEUCEMIE SCARSAMENTE DIFFERENZIATE O BIFENOTIPICHE
slide46

Posizione del gene MLL

 FISH LSI DOPPIO-COLORE

  •  La presenza di una traslocazione e’ evidenziabile
  • dalla formazione di due segnali separati:
  • segnale su cromosoma 11 con MLL :VERDE
  • segnale su cromosoma traslocato: ROSSO
  • segnale su cromosoma 11 normale: GIALLO
slide47

 Riarrangiamento di MLLt (?:11) (?;q23) in infant LAM M5

Risultato atteso

patologico

Traslocato

.

.

.

.

.

.

.

.

normale

Risultato effettivo

Normale

Risultato effettivo

Risultato effettivo

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

Interphase FISH

slide48

ArgBP2

4q35.1

NUOVO PARTNER DI TRASLOCAZIONE DI MLL

11q23 Partners

slide49

METAFASE NORMALE

METAFASE E INTERFASE TRASLOCATA

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

CARATTERISTICHE FISH PERTEL/AML1 ( LLA)

IN NUCLEI E METAFASI NORMALI SI HANNO I 2 SEGNALI ROSSI E 2 VERDI DISTINTI. NEI TRASLOCATI SI OSSERVA UN SEGNALE ROSSO (AML1 NORMALE) GRANDE, UNO VERDE (TEL NORMALE) GRANDE, UNO GIALLO (TEL/AML1 TRASLOCATO) E UNO PICCOLO ROSSO (RESIDUO DI AML1).

slide50

Metafase normale

Metafase con TRISOMIA

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

SONDE CHE COLORANO TUTTO IL CROMOSOMA. painting

slide53

Lab.Oncoematologia

Pediatrica (BO)

N-myc e amplificazione

HSR: Regione a colorazione

omogenea.

slide54

La FISH consente di:

Effettuare uno screening su un numero di cellule notavolmente superiore alla citogenetica classica.

Ridimensionare il valore prognostico negativo evidenziando la assenza di riarrangiamenti,anche in interfase.

Rilevare riarrangiamenti criptici in cellule con cariotipo apparentemente normale.

Identificare nuovi punti di rottura delle traslocazioni.

Rilevare la presenza di fenomeni di amplificazione genica

Ottenere una maggiore precisione diagnostica.

slide55

M-fish (Multiplex-FISH ) :uso di 24 sonde painting in fluorescenza per tutti i cromosomi, utile per sensibilità nei cariotipi complessi

• M-FISH e SKY: multicolor FISH con 24 sonde painting

(Speicher et al 1996; : Schrock et al1996);

slide56

M-FISH

applicazioni

•Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e double minutes;

•Caratterizzazione di traslocazioni complesse;

•Identificazione di inserzioni cromosomiche;

•Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’.

slide57

M-FISH

(Multiplex-FISH ) :

finalità

•analisi simultanea di tutto il corredo

cromosomico con un approccio rapido: un

singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo;

•sistema affidabile di caratterizzazione

contemporanea di tutti i riarrangiamenti

cromosomici nella cariotipizzazione di cellule neoplastiche

slide58

A

B

C

F

D

E

G

M-FISH

• Assegnazione di un colore diverso ad ogni cromosoma.

Separazione dei 24 cromosomi

(flow sorted)

Marcatura dei singoli cromosomi utilizzando varie

combinazioni di fluorocromi

•Per ottenere la simultanea visualizzazione di tutti i cromosomi vengono impiegate genoteche genomiche, ottenute per flow sorting o microdissezione dei cromosomi metafasici,marcate con 5 diversi fluorocromi o con una combinazione degli stessi.

Eppendorf con le sonde marcate

per i 24 cromosomi

IBRIDIZZAZIONE A 37°C PER 24/72 ORE

Steps di detection per visualizzare le sonde e rimuovere i nucleotidi non legati

VISUALIZZAZIONE DEI COLORI

Acquisizione con microscopio a fluorescenza

e camera CCD

CLASSIFICAZIONE DEI COLORI

Lunghezze d’onda selezionate e normalizzate

per ogni cromosoma

slide59

D = FITC

E = Cy 5.5

A = Rodamina

B = Texas Red

C = Cy 5

M-FISH

Ogni cromosoma è marcato con una combinazione unica di massimo quattro dei cinque fluorocromi utilizzati.

Si ottiene così una

specifica fluorescenza,

o spettro, per ciascun

cromosoma

slide60

M-FISH

Le immagini sono

catturate con sei

differenti

acquisizioni

slide61

M-FISH

• Combinando le

informazioni delle

acquisizioni

effettuate con i sei

filtri passa-banda

si ottiene, infine,

l’immagine totale.

slide62

M-FISH

Marker cromosomici

slide63

• Conclusioni

• La cariotipizzazione standard è notevolmente implementata dall’utilizzo di tecniche multicolor;

• M-FISH rappresenta un approccio ormai collaudato per l’identificazione di cromosomi marker, riarrangiamenti complessi e/o di dimensioni piccole.

• Nei casi con 3 o più breakpoint l’analisi M-FISH/SKY ha consentito di individuare, o ridefinire, riarrangiamenti cromosomici in almeno il 50% dei pazienti con LMA e LLA analizzati all’esordio della malattia (Veldman et al,1997; Kakazu et al, 1999; VanLimbergen et al, 2002; Nordgren et al, 2002; Calabrese et al, 2002);

Sviluppi futuri:

• L’aumento del numero dei fluorocromi impiegati dovrebbe migliorare notevolmente l’efficienza dell’analisi e la risoluzione di riarrangiamenti di piccole dimensioni (Saracoglu et al, 2001).

slide64

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION

CGH e’ un metodo di citogenetica molecolare per l’identificazione di modificazioni genetiche.

Le alterazioni sono classificate come guadagno di DNA (gain) o perdita di DNA (loss).

slide65

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION

Cellule Normali

CelluleTumorali

Estrazione DNA

DNAgenomico

normale

DNAgenomico

tumorale

Marcatura DNA

DNA normale

marcato

TRITC (rosso)

DNA tumorale

marcato

FITC (verde)

ibridizzazione

Metafasi normali

(prefissate sul vetrino)

Cattura dell’immagine con

microscopio a fluorescenza

slide66

METAFASE ACQUISITA CON MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

DAPI (controcolorante)

SOVRAPPOSIZIONE

DELL’IMMAGINE

TRITC (normale)

FITC (tumorale)

slide67

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION

(analisi dell’immagine)

+

DNA

tumorale

+

DNA

normale

Ibridazione su

metafasi normali

Colore giallo:

normale

Colore rosso:

perdita DNA tumorale

Colore verde:

eccesso di DNA tumorale

slide68

Vantaggi:

Analisi dell’intero genoma in un solo esperimento

Elevata sensibilità per le amplificazioni geniche

PROFILO:

Svantaggi:

Laboriosa.

Rileva solo guadagni e perdite, no riarrangiamenti bilanciati

Non è informativa sulla natura delle alterazioni cromosomiche.

conclusioni
CONCLUSIONI

La Citogenetica Molecolare è ormai entrata in tutti i campi della Medicina e, in particolare in quello Ematogico.

Le sue tecniche, sempre più perfezionate, hanno permesso non solo di ampliare le nostre conoscenze nel campo dellapatogenesi, ma anche di fornire uno strumento utile per un miglior inquadramento classificativo delle diverse forme morbose.

L’elevata sensibilità di queste tecniche permette in tutti i pazienti con marcatore molecolare una migliore valutazione della risposta terapeutica.