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Spanish Human Proteome Project (sHPP). Proyecto SRM CIMA.

Spanish Human Proteome Project (sHPP). Proyecto SRM CIMA. María I. Mora, Fernando J. Corrales Laboratorio de Proteómica, CIMA, Universidad de Navarra. *Adquirir. *Evaluar. *Optimizar!!!. *Adquirir. *Evaluar. Estrategia general. Datos MS/MS. Péptidos proteotípicos. Proteína de interés.

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Spanish Human Proteome Project (sHPP). Proyecto SRM CIMA.

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Presentation Transcript

  1. Spanish Human Proteome Project (sHPP). Proyecto SRM CIMA. María I. Mora, Fernando J. Corrales Laboratorio de Proteómica, CIMA, Universidad de Navarra

  2. *Adquirir *Evaluar *Optimizar!!! *Adquirir *Evaluar Estrategia general Datos MS/MS Péptidos proteotípicos Proteína de interés Secuencia Transiciones Peptide verification Crear Método MRM Crear Método MRM “optimizado” Crear Método MRM “definitivo” (Scheduled) Final Method

  3. 20 proteínas asignadas a CIMA

  4. Prueba preliminar en células Huh7 • Preparación de la muestra • Lisis: en Urea 7M / Thiourea 2M / CHAPS 4% / DTT 40mM • b) Precipitación: cleanup kit (BioRad) Pellet resuspendido en Bicarbonato de Amonio 50mM • PROBLEMA: Resuspensión!!!! • Digestión: Reducción 10mM DTT, 56ºC, 30’ • Alquilación 28mM IAA, RT, 20’ • Digestión 1:50, 37ºC, o/n • d) A QTRAP 5500: 1 ug / run

  5. 1 2 and 3 Ignore if: -KK/ KR/ RR/ RK (end) -end of sequence 4 Transiciones: Definidas por MRM pilot

  6. Métodos MRM individuales

  7. Condiciones LC Pickup: 2ul Loading: 8min (3ul/min) Gradiente: 60 min (300nl/min)

  8. Analyst MRMpilot y4 b4 y5 b5 y6 b6 Ejemplos Proteina: AARS Peptido: ALNEALK / 379.72 TR: 22.4’ Programadas: 6 Observadas: 6

  9. MRMpilot Analyst Proteina: TRIM72 Peptido: ILEAHVEAK / 505.29 TR: 20.6’ y6 y7 y8 y5 b8 Programadas: 6 Observadas: 5 *

  10. MRMpilot Analyst Proteina: TELO2 Peptido: FDRPLVTFDLLGEDQLVLGR / 768.42 TR: 40.34’ y8 y7 y10 Programadas: 5 Observadas: 5 y9 y11

  11. b5 y4 b6 y5 y6 Analyst Proteina: SRRM2 Peptido: STTPAPK / 351.19 TR: 16.24’ Programadas: 5 Observadas: 5

  12. MRMpilot Analyst b6 ! ! b5 y4 y5 Proteina: CHD9 Peptido: TEEQVQK / 431.22 TR: 21.65’ Programadas: 5 Observadas: 4

  13. Analyst MRMpilot y10 y7 y5 y9 y8 y11 y7 y10 y8 y9 y11 y5 Proteina: ARGHAP17 Peptido: DPVSAAVPAPGR / 568.81 TR: 19.85’ – 21.41’ Programadas: 6 Observadas: 6

  14. Analyst y5 y4 b5 b6 y6 y4* b6 b5 E en N-terminal y4 y6 y5 Proteina: DNAJA2 Peptido: ENEVFQR / 472.73 TR: 16.3’ – 25.5’ Programadas: 6 Observadas: 6 / 5 *

  15. Resultados MRM (peptide verification- I)

  16. Resultados MRM (peptide verification- II)

  17. Resultados MRM (peptide verification- III)

  18. *Adquirir *Evaluar *Optimizar!!! *Adquirir *Evaluar Estrategia general Datos MS/MS Péptidos proteotípicos Proteína de interés Secuencia Transiciones Peptide verification Crear Método MRM Crear Método MRM “optimizado” Crear Método MRM “definitivo” (Scheduled) Final Method

  19. Condiciones QTRAP 5500 MRM- Peptide Verification

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