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Lima, UIGV, Junio 2013. Química de los Flavonoides, Aislamiento y caracterización de Isoflavonas y su Actividad Biológica. Q.F Heinz Jungbluth Ganoza. Introducción.

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Presentation Transcript
q f heinz jungbluth ganoza

Lima, UIGV, Junio 2013

Química de los Flavonoides, Aislamiento y caracterización de Isoflavonas y su Actividad Biológica

Q.F Heinz Jungbluth Ganoza

introducci n
Introducción
  • Pigmentos naturales con una estructura carbonada C3-C6-C3 o mas, específicamente con un grupo fenilbenzopirano, dependiendo de la unión del grupo aromático con el núcleo benzopirano (cromano) serán, flavonoides 2-fenilbenzopirano, isoflavonoides 3-benzopirano, neoflavonoides 4-benzopirano
isoflavonas
Isoflavonas
  • Distribución: Las Isoflavonas se hayan presentes mayoritariamente en la familia de las leguminosas (Fabaceae) , preferentemente en la subfamilia papilionideae, existen grandes revisiones de investigaciones sobre la presencia de Isoflavonas en esta subfamilia como la de Veitch (2007, 2009). Se encuentran presentes en los frutos de esta familia (Legumbre) y en las raíces o rizomas (mecanismo de fijacion de Nitrogeno)
isoflavonas1
Isoflavonas
  • Características químicas resaltantes: Las isoflavonas difieren de sus respectivos flavonoides por la migración de un anillo aromático de C2 a C3. Mayores cambios en la estructura dependerán de su Hidroxilacion, metoxilacion, o metilendioxisustitucion, prenilacion y Glicosilacion.
bios ntesis1
Biosíntesis

Las Isoflavonas proceden de la ruta de los Fenilpropanoides, pero el paso crucial para convertirse en Isoflavonas esta en la conversión de la respectiva flavanona en una Isoflavona, la enzima que realiza este proceso es la 2-hidroxiisoflavanona sintetasa (2HIS) luego se produce una dehidratación mediante la 2-hidroxiisoflavona dehidrasa convirtiéndola en una Isoflavona( todas estas enzimas ya han sido caracterizadas convenientemente)

bios ntesis2
Biosíntesis
  • Regulación:
  • La vía del ácido shikímico es dependiente de la luz.
  • La acción de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la vía biosintética de los flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por ello está estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina amonioliasa es activada por la luz, y depende además de la concentración de diferentes hormonas vegetales. La actividad de la fenilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los vegetales se les somete a situaciones de estrés, como puede ser la falta de agua ("estrés hídrico"), infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV, y el frío (por esto último las plantas sometidas a bajas temperaturas suelen presentar coloraciones rojizas en tallos y hojas, y cuando los inviernos son muy fríos, las flores desarrollan colores muy intensos en la primavera siguiente).
  • Hay isozimas dedicadas a la producción de flavonoides diferentes en respuesta a señales ambientales diferentes
slide17

SECUENCIA DE

INVESTIGACION

DESECACION

OBTENCION DEL

MATERIAL

IDENTIFICACION

- Por un botánico de

experiencia

- Buen manejo de literatura

- Guardar muestra

herborizada

- Para eliminar H2O y

evitar alteración.

- Hacerle gradualmente--

cambios de lugares.

- Aire libre, en el sol

sobre papel que se cambia

diariamente.

- Estufa: temperatura

controlada+ aire forzado

- Colectar planta completa,

flor y fruto.

- Por duplicado.

- Anotar nombre vernáculo

y científico.

- Hábitat, tamaño, aspecto y

color de los órganos

recogidos

- Clima, altitud, abundancia

o escasez de la especie.

- Una foto.

aislamiento
Aislamiento
  • Existen muchas vias de aislar y separar una isoflavonas, lo mas importante es reconocer el material del cual se esta extrayendo (material vegetal, muestra biológica, Alimento), la presencia de carbohidratos y compuestos lipofilicos, afectara el desarrollo del metodo.
aislamiento1
Aislamiento
  • SPE: (Solid PhaseExtraction): Para poder evitar la mayor cantidad de interrupciones en la matriz, como medio de purificación podemos utilizar cartuchos de SPE C1; eluyendo el extracto en el cartucho y luego pasando a través del mismo MeOH con pequeñas concentraciones de Acido acético.
aislamiento2
Aislamiento
  • Partiendo de una muestra vegetal: La utilización de Material Seco, podría hacer decrecer la presencia de Isoflavonas, de preferencia utilizar material fresco. Flavonoides altamente acilados suelen ser lábiles a temperaturas muy altas y frecuentemente son degradados durante el proceso de secado.
aislamiento3
Aislamiento
  • Si estamos buscando agliconas en el material vegetal, podemos realizar un lavado con solventes no polares como el caso de cloruro de Metileno, éter di etílico, acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo la forma de agliconas)
  • Normalmente la extracción podemos realizarla bajo un equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la presencia de Agliconas en dicho extracto.
  • Luego podemos proceder a realizar una extracción con mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extracción puede mejorar con sonificacion del material vegetal
aislamiento4
Aislamiento
  • Los flavonoides en el material vegetal se encuentran siempre conjugados con o-glic o c-glic, raramente se encuentra bajo la forma de aglicona.
  • Para casos practico de aislamiento sera necesario separar estos glucósidos del esqueleto de los flavonoides, para esto se propone una hidrolizar acida.
aislamiento5
Aislamiento

Sistemas Cromatográficos para la extracción: existen varios sistemas para la extracción de las Isoflavonas mediante columnas Cromatográficas.

Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20, C18 RP

Fases Móviles: Migración y mixturas de compuestos Polares a Hidrófobicos

slide25

Solventes de

desarrollo

-Hexano

-Tetracloruro de carbono

-Benceno

-Diclorometano

-Cloroformo

-Eter dietilico

-Acetato de etilo

-Acetona

-Isopropanol

-Etanol

-Metanol

-Agua

Aumenta

el poder

eluyente

Serie

eluotropa

El poder eluyente

aumenta con la

Polaridad del

disolvente

Polaridad

creciente

caracterizaci n
Caracterización
  • Son moléculas difíciles de caracterizar, normalmente se determinan bajo el brillo en presencia de fluorescencia, de color azul intenso, que cambia a Marrón intenso en presencia de vapores de amoniaco.
espectroscopia uv
Espectroscopia UV
  • La banda II de absorción de las Isoflavonas normalmente ocurre en la región de 245-270 nm y generalmente no es afectada por el incremento de la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada bato crómicamente por Hidroxilacion del anillo A
  • Características de las espectroscópicas:
  • Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de absorción, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas en el anillo A.
  • La metilación o Glicosilacion de 7 o 4’-OH tiene un pequeño o muy pequeño efecto sobre el espectro UV, Mientras que una sustitución en el 5-OH causa un ligero desplazamiento Hipsocromico.
espectroscopia uv1
Espectroscopia uv

Reactivos de Desplazamiento

t cnicas espectrom tricas
Técnicas Espectrométricas
  • Los tipos de análisis mas importantes para el trabajo con flavonoides, son los relacionados con la Espectrometría de MS, MS/MS y la RMN 1H y RMN 13C.
  • El trabajo con IR no ayuda en gran manera, debido a la cantidad de señales iguales, que se solaparían.
slide47

Espectrometría de masas

Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se separan al ser acelerados por un analizador de masa: la separación se basa en la distinta relación m/z de los iones.

slide48

ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Componentes del instrumento

Detector iónico

Separador de masas

Fuente de ionización

Introducción de la muestra

Procesador de señal

El acoplamiento entre CG y HPLC con EM se analizará más adelante

Registrador

slide49

Fuentes de ionización

  • Ionización por impacto electrónico
  • Ionización química
  • Fuente de bombardeo con átomos rápidos
  • Desorción con láser
  • Ionización a presión atmosférica:
  • -Electronebulización asistida con un gas: electrospray
  • - Ionización química a presión atmosférica
  • - Fotoionización a presión atmosférica

HPLC

slide50

filamento de W

iones

M + e M.+ + 2e

Ionización por impacto electrónico

moléculas neutras

moléculas neutras

placa de repulsión

haz de electrones (70 eV)

placas aceleradoras (4000 V)

placas focalizadoras

ion molecular

slide51

ABCD + e ABCD.+ + 2 e

ABCD.+ A+ + BCD.

A. + BCD+ BC+ + D

CD. + AB+

AB. + CD+

B + A+

A + B+

D + C+

C + D+

BC. + AD+

AD. + BC+

ABCD.+ ADBC.+

Fragmentación del ion molecular

Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)

Fragmentación del ion molecular

Reordenamiento seguido de fragmentación

Colisión seguida de fragmentación

ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+

slide52

Gas reactivo metano, isobutano, amoníaco (cámara de ionización de “alta” presión a 10 torr)

CH4 + e (alta energía) CH4+ y CH3+

CH4+ + CH4 CH5+ + CH3

CH3+ + CH4 C2H5+ + H2

CH5+ + MH MH2+ + CH4

C2H5+ + MH M+ + C2H6

Ionización química

Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito

slide53

Separador de masas

  • Espectrómetro de masas de sector magnético
  • Espectrómetro de masas de cuadrupolo
  • Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo
  • Espectrómetro de masas de trampa iónica
slide55

Ecinética = ½ mv2 = zV

v = (2zV/m)½

FM = Bzv

FC = mv2/r

mv2/r = Bzv

v = Bzr/m

¿cómo se separan los iones de distinta masa?

m : masa

v : velocidad de la partícula

m : masa

z : carga

V : diferencia de potencial

FM : fuerza centrípeta

FC : fuerza centrífuga

B : campo magnético

r : radio de curvatura

Bzr/m = (2zV/m)½

m/z = B2r2/2V

slide56

Ø = 6 mm

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

slide58

Potencial corriente directa

Potencial de radiofrecuencia

tiempo

masa

Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo

slide59

EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)

pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s

slide60

Espectrómetro de masas de trampa iónica

Vrf

electrodo anular central

tapa

tapa

slide62

Espectros de masas

Dependen de:

Energía de ionización de la molécula

Grupos funcionales de la molécula

Método de ionización

Presión y temperatura de trabajo

Diseño instrumental

slide63

pico base

Etilbenceno

Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico

En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3

ion molecular (ion “parent”)

molécula con número par de N →M+ con masa par

M+ → fragmento de mayor masa

molécula con número impar de N→ M+ con masa impar

4 H → M-4 F → M-19

CH3→ M-15 HF → M-20

NH3 → M-17 C2H2 → M-26

H2O → M-18

Átomos y grupos frecuentemente desplazados

slide64

Picos isotópicos

12C1H235Cl2 (m= 84)

13C1H235Cl2 (m= 85)

12C1H235Cl37Cl (m= 86)

13C1H235Cl37Cl (m= 87)

12C1H237Cl2 (m= 88)

Espectros de masas de cloruro de metileno

Impacto electrónico

pico base → pérdida de Cl

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Espectros de masas de pentobarbital (sedante)

Ionización química

Impacto electrónico

El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue

slide66

Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)

Impacto electrónico

Ionización química

slide69

Ensamblaje con columnas capilares

hacia la bomba

cámara de evacuación

A cámara de ionización

desde el CG

tubo de vidrio poroso

constricción de entrada

constricción de salida

collarín que se atornilla en el receptáculo de fuente iónica

slide70

Cromatografía Líquida – Espectrometría de Masas

Sistema de acople

Sistema de ionización

slide71

Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución

Ionización a presión atmosférica

  • Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI)
  • Ionización química a presión atmosférica (APCI)
  • Fotoionización a presión atmosférica (APPI)
slide73

Electrospray (ESI)

1. La fasemóvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñasgotas)

2. El solvente de la fasemóvil se evapora de lasgotas (desolvatación)

3. La densidad de carga en lasgotasaumentahastaalcanzar el límite Raleigh (10e8V/cm3) y luego la gotasufreexplosiones de Coulomb y se rompe en gotasmáspequeñas.

4. Bajo la influencia de potencialeselectrostáticos en la cámara de spray (nube), el ion analito se desorbe de la gota.

slide74

Electrospray

aerosol

líquido

slide76

¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?

  • Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de interés debe ser capaz de portar carga en solución
  • Ejemplos:
  • a) Muestras que contienen heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas
  • b) Ácidos o bases
  • c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc
  • d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteinas,
  • oligonucleotidos)
  • e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida
  • A evitar: muestras con grupos no polares en los que la inducción de carga no sea un proceso eficiente
slide78

Ionización química a presión atmosférica (APCI)

1. La fasemóvil y el analitose nebulizan (dispersados en pequeñasgotas)

2. Las gotas se evaporan.

3. Las moléculas de fasemóvil se ionizanporelectronesprovenientes de unadescargaeléctrica.

4. Las moléculas de analitose ionizanporlos iones de la fasemóvil.

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La muestra y el solvente vaporizados entran en la región corona entre la aguja y el capilar

  • Las moléculas de solvente se ionizan en la región corona de descarga, transformándose en iones gaseosos reactivos
  • Estos iones reactivos reaccionan con las moléculas de muestra, ionizándolas
slide82

¿Cuándo es apropiado trabajar en APCI?

Muestras: Compuestos de peso molecular/polaridad intermedias: PAHs, PCBs, ácidos grasos, ftalatos.

Compuestos que no contienen grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos, alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)

Muestras con heteroátomos: ureas, benzodiacepinas, carbamatos

Muestras que exhiben un mal comportamiento ESI

Parámetros en solución

Mucho menos sensible a las condiciones de disolución que ESI

Tolera mayores flujos que ESI

Acomoda algunos solventes no compatibles normalmente con ESI

Muestras a Evitar

Debido a la evaporación previa: muestras térmicamente lábiles,

muestras cargadas en solución, biomoléculas (habitualmente no volátiles).

slide84

APPI (modo positivo)

El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados por calefacción.

• La ionización del solvente y la muestra ocurre por bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV

slide85

La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón).

El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar [M+H]+

Un dopante fotoionizable en exceso y rinde muchos iones moleculares.

El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente

El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica

slide87

¿Cuándo usar APPI?

  • Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI o APCI (ej: PAHs).
  • Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos (THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no hidrosolubles).
  • Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que APCI.
  • Es robusto y altamente reproducible.
slide88

Selección del sistema CL/EM

100.000

ESI

10.000

Peso molecular

APPI

1.000

APCI

No polar

Muy polar

Polaridad del analito

slide89

Registros gráficos CG-EM y CL-EM

  • Cromatograma de corriente iónica total
  • Cromatograma de ión seleccionado
  • Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información cromatográfica) y en función de la relación m/z (información espectroscópica)
slide90

Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)

CH3(CH2)3OH + Br- CH3(CH2)3Br + OH-

1-butanol

1-bromobutano

cromatograma

EM pico 1

EM pico 2

slide91

Combustión de tela tratada con producto ignífugo

Cromatograma de corriente iónica total (TIC)

EM de pico 12 (benceno)

slide92

Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa

Cromatograma de corriente iónica total

EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución

EM del pico a 11.5 min

slide93

Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-masas

Cromatograma convencional con detección UV

Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH+ formado a partir de imazaquina de masa = 311)

Cromatograma de masas de corriente iónica total

slide94

Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en modo barrido completo (full-scan)

Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)

ms en flavonoides
MS en Flavonoides
  • Cantidad de muestra necesaria: Menos de un 1mg, esta técnica junto con el análisis UV y los reactivos de desplazamiento.
  • La técnica a escoger puede variar dependiendo de la matriz y tipo de flavonoides a analizar. (FAB, MALDI, TOF, EI)
  • El análisis se debe llevar a cabo siempre con agliconas, esto debido a que los glucósidos son altamente termolábiles, incluso existiendo una gran presión de vacío (3 x10-5 Torr)
slide101
RMN
  • Esta tecnica es muy usada para el analisis de flavonoides, especialmente en las isoflavonas, al ser estructuras altamente metiladas.
  • Ademas de ser muy solubles en el solvente que se utiliza para la RMN CDCL3, sin embargo otra vez se observa que el analisis de los glicosidos, disminuye la solubilidad en CDCL3
  • Sin embargo el uso de DMSO d6, facilita de sobremanera el analisis de glicosidos.
  • La utilizacion de TMS tambie es apropiada para el analisis de Flavonoides, ya que generan rapidamente derivados de estos.
slide104

Para la elucidación de la estructura tomaremos en cuenta los siguientes puntos:

  • Protones del Anillo A
  • Protones del Anillo B
  • Protones del Anillo C
  • Protones del Glucósido
  • Metoxi y Acetoxi Protones
  • Protones del carbono 6 y 8

Nota: Tener en cuenta si se usa TMS, todos los OH terminales seranTrimetilsilil esteres.

slide105

Los protones de los carbonos 6 y 8 de las isoflavonas que contengan sustituciones en los carbonos 5 y 7, presentaran 2 dobletes (J: 2.5cps) en el rango de 6.0 y 6.5. Los dobletes correspondientes a H-6 ocurren consistentemente mas altos que los del 8-H, cuando existen azucares en el C-7 la señal se desplaza en el espectro

slide106

Otro caso común es que la isoflavona presente una sustitución en el C-7 Cuando R=H, tenemos que los hidrogenos del carbono 5 genera un doblete entre 7.9 y 8.2, El carbonos 6 generara un cuarteto entre 6.7 y 7.1 y el carbono 8 un doblete entre 6.7 y 7.0, cuando la sustitución es diferente a la de un H, todos los desplazamientos se ven reducidos.

slide107

Anillo B: para nuestro interés en las isoflavonas, los desplazamientos como dobletes entre 7.2 y 7.5 y 6.5 y 7.1, nos darán la explicación de un enlace =C-C= en la posición 3, corroborando la presencia de la estructura correspondiente a las Isoflavonas.

isoflavonas3
Isoflavonas
  • Las Isoflavonas presentan una gran cantidad de actividades, aunque cabe resaltar que la mayor cantidad de Isoflavonas presentar actividad estrogénica, de ahí que reciben el nombre de Fitoestrógenos.
  • Estos compuestos presentan una estructura estérica muy similar a la de esteroidal de los estrógenos, por lo cual se unen fácilmente a los receptores estrogénicos. De ahí que produces una infinidad de efectos estrogénicos o anti estrogénicos.
absorci n metabolismo y excreci n
Absorción, Metabolismo y excreción
  • Las isoflavonas son absorbidas a nivel de la parte superior del intestino delgado. Pasan la barrera hematica alrededor de una hora después de haber sido ingeridas.
  • Son absorbidas bajo la forma de aglicona, por lo que previamente se realizada un hidrolisis enzimática, por la B-glicosidasa de la flora bacteriana o por la enzima instestinal, lactasa-florizina hidrolasa.
absorci n metabolismo y excreci n1
Absorción, metabolismo y excreción
  • Posteriormente a nivel de la mucosa intestinal son convertidas a la forma de B-glucoronico por la enzima UDP-Glucoroniltransferasa , convertida luego bajo la forma de sulfato catalizado por PAPS. Estos procesos ocurren a nivel del Hígado.
  • Luego estos son excretados a nivel biliar, y reabsorbido en la porción final del intestino delgado, creando un ciclo entero-hepatico.
  • Para ser luego excretado vía urinaria, bajo la forma de DMA (desmethylangolensin).
mecanismo de acci n
Mecanismo de Acción

Síntomas Menopaúsicos:

Las isoflavonas con su estructura estérica similar a la del estrógeno, se une a sitio receptor de estrógenos, produciendo efectos vasomotores importantes, diversos estudios clínicos, dan como dosis diaria 135 mg de Isoflavonas expresadas como mg de Genisteina.

efectos ben ficos
Efectos Benéficos
  • Anticancerígeno: Uno de las posibles explicaciones, o modelos de mecanismo de acción es tan indicados a que las isoflavonas, evitan la proliferación de células cancerígenas activando las vías de apoptosis, inhibición de la Tirosina Quinasa, y regulación de los ciclos hormonales.
efectos ben ficos1
Efectos Benéficos
  • Efectos sobre la cognición: El hecho de activar receptores hormonales, da como resultado un incremento en la producción de neurotransmisores, lo cuales van a producir una mayor actividad cerebral, llegando a mejorar los procesos cognitivos del cerebro.
practica de laboratorio
Practica de Laboratorio
  • Traer:
  • Mta problema (planta, material vegetal, materia biologico), que contenga una cantidad y molecula conocida de Isoflavonas.
  • Jeringas de 10 ml
  • Guantes
  • Guardapolvos
  • Muchas Ganas de trabajar
slide125

FIN

Gracias