Universit di trieste e padova ingegneria chimica
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Università di Trieste e Padova Ingegneria Chimica. MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory - CASLAB Supervisore: Prof.ssa Sabrina Pricl. Ricerca di Dottorato Maria Silvia Paneni XIX Ciclo. Tesi. Titolo:.

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Universit di trieste e padova ingegneria chimica

Università di Trieste e PadovaIngegneria Chimica

MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory - CASLAB Supervisore: Prof.ssa Sabrina Pricl

Ricerca di Dottorato Maria Silvia Paneni

XIX Ciclo


Universit di trieste e padova ingegneria chimica
Tesi

Titolo:

“Studio funzionale di proteine coinvolte in patologie generali e virali con tecniche di simulazione molecolare assistite al computer”


Le proteine
Le Proteine

a) Il malfunzionamento

(uomo)

b) La Buona attività

(Microrganismi:Virus Batteri, funghi)

Patologie


Approccio
Approccio

Interpretazione Termodinamica di:

a) Relazione Causa – Effetto del cattivo funzionamento;

  • Legame Farmaco – Proteina:

    _Wilde Type = Attività

    _Mutazione = Resistenza.


Universit di trieste e padova ingegneria chimica

Obbiettivo

Determinare una “Chiave”

Supporto della ricerca farmacologica

Modello Molecolare

RAZIONALE- COMPUTAZIONALE

Per interpretare e prevedere

Modello Clinico

Fenomeni Chimico -Fisici

Ing.Chimica

Informatica

Letteratura

Enti di ricerca

Scambi Culturali


1 fhm hcm
1. FHM - HCM

1.Studio delle relazioni genotipo-fenotipo delle mutazioni della β-Miosina coinvolte in patologie come la cardiomiopatie ipertrofiche


1 1 introduzione
1.1 Introduzione

HCM: Eziologia oscura:

Ipertrofia, disordinedei miociti , aumento del tessuto connettivo

Mutazioni della βMHC

(50% dei casi)

Beta-miosina + Actina = attività ATPasica driving-force (power – stroke) della contrazione

“Iprocessi di rimodellamento possono essere meccanismi compensatori “(Cell vol 104, 557-567)”

“il cuore diventa più grande per compensare la riduzione della forza\potenza“(Miller et al 2003)

Cardiovascular Istitute,University of Colorado at Denver, CO USA

Obiettivo :Cercare un RAZIONALE tra il Modello Molecolare e quello Clinico


1 2 metodologia
1.2 Metodologia

  • Modellazione con omologia della 3D β-MHC

  • VALUTAZIONE del ΔΔGbind tra

  • COMPLESSO WT e MUTANTE

  • ΔΔGbind=ΔGbind(WT) - ΔGbind(MUT)

  • ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS

  • metodo Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA-Kollman’90),utilizzando i dati ricavati con dalla Dinamica Molecolare

  • ΔΔGbind<0 Complesso WT più Favorito del Mutante


1 3 risultati conclusione
1.3 Risultati / Conclusione

Abbiamo ottenuto ΔΔGbind < 0

Ecco il RAZIONALE :

Mut= Meno energia

Ridotta Driving Force

LOSS on FUNCTION

EFFETTO COMPENSATORE: SLITTAMENTO delle miofibrille dal loro assetto naturale ed INGROSSAMENTO del tessuto miocardiaco MIOCARDIOPATIA IPERTROFICA


1 4 collaborazione
1.4 Collaborazione

Molecular Genetics Laboratory of the University of the Colorado, Cardiovascular Istitute, Denver, CO USA;


2 antivirali hiv
2. Antivirali - HIV

2. Studio e sviluppo di principi attivi anti – HIV: Resistenza

a_Studio Farmacoforo della resistenza dell’HIV a farmaci inibitori della HIV- TI

b_Studio della Resistenza dell’HIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Inversa


2 introduzione
2. Introduzione

21.8 milioni fino ad oggi i casi di decesso per AIDS nel mondo

I due siero tipi HIV1 e HIV-2 appartengono alla famiglia dei Retrovirus che è una sotto classe dei Lentivirus;

Approccio:

TI

Mutazioni

Complesso Inattivo

Inibitori NNIs e NIs

+

=

Resistenza = mutazioni per vincere il farmaco

Errore di trascrizione

Obiettivo

Valutare la Resistenza del HIV a inibitori della TI


2a metodologia
2a. Metodologia

2a.Studio Farmacoforosu Indoli :

Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend dicomposti con attività nota nel caso wt e K103N e Y181C. Abbiamo stimato l’attività dei nuovi composti“mappandoli “in tali modelli( EC50 = concentrazione M del farmaco necessaria per bloccare l’attività del virus in cellula del 50%. )

Modello 3D per HIV-1 (es) monomutante-Ricavato da trend di composti con attività nota

  • Fucsia: Donatore legame idrogeno;HBDn

  • Verde: Accettore legame idrogeno ;HBAc

  • Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr


2a risultati conclusione
2a. Risultati / Conclusione

  • Concordanza dati sperimentali e stimati

  • Previsioni accettabili di attività;

  • Sono circa 2000 con ottime attività antivirali oggetto di studio di Idenix-Novartis.

  • I modelli 3D ottenuti sono risultati adeguati per affrontare questo caso di studio sulla Resistenza


2b metodologia
2b. Metodologia

2b.Studio con Modellazione Molecolare della Resistenza dell’HIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Inversa:

Analisi dellaVa =variabilità dei residui nel sito allosterico di legame NNRTIs - HIV-RT derivata sulla base della sequenza di differenti specie. Le (SCR)s hanno caratteristiche funzionali. E valutare se

Residuo Candidato a Resistente

GV = ΔGAA * Va

ΔGAA contributo di energia libera di legame di un dato amminoacido derivante dalla dinamica molecolare

< - 0.35Resistente

10xKi

Wang and Kollman,2001,parametro empirico


2b risultati conclusione
2b. Risultati / Conclusione

  • Perfetto accordo con i dati in letteratura riguardo ai residui resistenti;

  • Ottime previsioni su residui resistenti.

  • Per il 9-CL TIBO :

  • Residuo Letteratura GV

  • Y181 Y181C - 2.4

  • K103 K103N - 3.9

  • Per il 8-CL :

  • Residuo Letteratura GV

  • Y181 Y181C - 1.3

  • K103 - - 0.41

Valida metodologia di carattere predittivo sulla Resistenza dell’HIV ai farmaci , utile per il design di migliori


The winner is
The winner is

Il suddetto lavoro dal titolo “Prediction of HIV-1 Resistance to NNRTIs: a Computer-aided Molecular-based Rationale“ ,ed I relativi risultati sono stati presentati al “International Conference HIV DART 2004”, Montego Bay-Giamaica 11-19 dicembre 2004 ed è stato riconosciuto tra tutti quelli presenti come il migliore .

Collaborazione :

Idenix - Novartis

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche dell’Università di Cagliari


3 antivirali hcv
3. Antivirali - HCV

3. Studio e sviluppo di principi attivi anti HCV

a_Studio Farmacoforo di Diketoacidi Inibitori della NS5B

b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-polymerase


3 introduzione
3. Introduzione

Il 3% della popolazione mondiale è cronicamente

Infetta. 85% Cronicizzazione

20% Cirrosi 75%Epatocarcinoma

Pestivirus(BVDV)

Hepacivirus(HCV)

Flaviviridae

Similarità Genomica (RNA+)

Flavivirus (YFV) Dengue fever virus (DENV))

Bassa repilcabilità in vitro

Test in vitro su BVDV

Complesso Inattivo

Inibitori NNIs e NIs

+

=

NS5B

Obiettivo : Valutazione dell’attività di Inibitori Non nucleosidici

e Nucleosidici della NS5B – RNA dipendente – RNA Polymerase


3a metodologia
3a.Metodologia

3a.Studio Farmacoforosu NNI - Diketo acididerivati:

Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend di 40 molecole con attività note .

L’abbiamo testato su un 29 composti noti

Abbiamo stimato le attività su nuovi DKAs derivati :

  • Modello 3D di Attività

  • Blue:Negativo ionizzabile; 1Neg I

  • Verde: Accettore legame idrogeno ; 2HBAc

  • Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr


3a risultati conclusione
3a.Risultati / Conclusione

In generale venivano mappati sempre 1HB Ac ( N, O ), Neg I ( al gruppo carbossile ) e 1HyAr ( Ring)

Per il 90% era mappato il secondo HB Ac

Per il 70% l’altro Hy Ar

Concordanza tra I dati sperimentali e stimati ottime previsioni;

N

N 2

Activ:0.056 (M )

Estimate: 0.096 (M )

N28

Activ:30 (M )

Estimate : 25 (M )

Il modello è risultato valido per la stima di nuovi Diketo acidi derivati inibitori della NS5B dell’HCV


3a conclusione
3a. Conclusione

I risultati di tale lavoro sono contenuti nel articolo dal titolo:“A simple but effective three-dimensional chemical feature-based pharmacophore model for diketo acid derivatives as hepatitis C virus RNA-dependent RNA-polymerase inhibitors “, Journal of Medicinal. Chemistry (2005)vol 48, pp.6304-6314

Collaborazioni:

“Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti"-Dipartimento di Studi Farmaceutici, Università di Roma


3b metodologia
3b. Metodologia

1

3b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-polymerasecon la Modellazione Molecolare:

Note le attività e i siti allosterici 1 de Shire A, Shire B e Pfizer 1: a 35A dal sito attivo. Recentemente scoperta l’esistenza di un sito allosterico 2 di legame superficiale specifico per rGTP, locato a 30 Ǻ dal sito catalitico, nella interfaccia dita- pollice

Alcuni HNIs AD1 e AD2 , avevano mostrato un’attività confrontabile con quella della Ribavirina (unico NI in commercio)

2

NS5B

Base Azotata

Abbiamo modificato i gruppi funzionali e base azotata e valutato con la dinamica molecolare ΔGbind per ogni complesso doccato NS5B – HNI per il BVDV e HCV e calcolato le attività

ΔGbind = RTlnKdissRTlnIC50

Kroeger Smith,2000;Wang et al. 2001

IC50 : concentrazione Mdel farmaco necessaria per bloccare del 50% l’attività dell’enzima puro .


3b risultati
3b. Risultati

  • Procedura validata: testata per i tre inibitori conosciuti ShireA e ShireB e Pfizer 1:Concordanza con l’attività sperimentale e la struttura cristallografica note

  • Concordanza dati

    sperimentale e calcolati;

  • Ottime previsioni ;

BVDV

HCV

La metodologia computazionale è risultata valida per la verifica e predizione dell’attività di inibitori su HCV


3b risultati conclusione
3b. Risultati / Conclusione

I risultati di tale lavoro sono contenuti nel manoscritto, dal titolo:”Hindered Nucleoside analogs as inibitors of HCV RNA-dependent RNA-polymerase: evolving visitas” che è pubblicato in “Framing the knowledge of viral hepatitis”, edited by Rymond F.Schinasi, and E.R. Schiff, IHL Press Arlington MA,US, pp. 279-318 (2005) .

Collaborazioni :

Dipartimento di Scienze Farmaceutiche - Università di Ferrara,

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche , Sezione di Microbiologia , Virologia Generale e Biotecnologie Microbiche e Laboratori Cooperativi Idenix - Università di Cagliari.


4 antifungini antibatterici
4. Antifungini – Antibatterici

4. Studio Sperimentale e Computazionale dell’attività Antifungina e Antibatterica di nuovi Imidazoli e Triazoli derivati


Universit di trieste e padova ingegneria chimica

4.1 Introduzione

Candida = Funghi

M.Tuberculosis = Bacteria

Derivati Azolici = Antifunginie Antibatterici (gram positivi)

Stesso meccanismo :Inibizione de lanosterolo C-14αdemetilasi, dipendente dal citocromo P450, Eme – thiolata proteina

Complex:P450 – Inibitore Azolico

(struttura cristallografica)

Obiettivo: Valutazione dell’attività di Nuovi Derivati Azolici (imidazoli e triazoli)antifungini e anti batterici


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4.2 Metodologia

4.2.1 La Chimica :Sintesi e Test di Attività di Nuovi derivati Azolici (C.Albicans ,Glabrata M.Tuberculosis)

La parte aryl - azolyl – etano legata con legame azometino alla piridina -2- carboxamidrazone , una parte chimica che è strato dimostrato possedere un importante attività anti mycobacterica ; presso l’Istituto di Scienze Farmaceutiche di Trieste .


Universit di trieste e padova ingegneria chimica

4.2Metodologia

4.2.2 La Modellazione Molecolare:

a) Homology Modeling:3DP450-Candida Albicans

  • La struttura del citocromo P450 -14 DM del M.Tuberculosis era disponibile presso il Protein data bank codice : 1E9X

  • Costruzione del modello 3D per Candida Albicans .Alta conservazione della struttura delle omologhe P450s.Allineamento delle sequenze aminoacidiche del citocromo P450 della C. Albicans , C. Tropicalis , C. Glabrata , C. Krsuei e M. Tuberculosis.

SCR

Foglietti

Eliche


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Homology modeling

Struttura 3D de citocromo P450 Candida Albicans

Centro attivo della catalisi : ilnucleo di

Fe- protoporphyrin ( eme)


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b)Interazione Enzima - Farmaco

Modellazione dei nuovi composti

Byopolimer Modulo di INSIGHTII

Docking del farmaco all’interno del sito attivo del P450

Calcolo dell’Energia di Legame: ΔGbind

ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS < 0

L’energia libera di legame ΔGbind di ciascun complesso farmaco – 14 DM in acqua è stato calcolato in accordo alla così chiamata procedura Molecular Mechanics/ Poisson –Boltzman Surface Area (MM/PBSA)

Kollman’90


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4.3 .1Risultati - La Chimica

MIC

MIC

MIC

MIC

MIC=Conc.Minima Inibente (mg/L)-48h Candida-8g TBC

I nuovi Azoli hanno dimostrato attività antifungina e antibatterica. Analogia per I microrganismi – I composti 2b e 2c (quelli alogenati Br e Cl) con circa 1mg/l (Candida ) e 4mg/L ( Tuberculosis) sono risultati I più attivi. I triazoli I meno attivi. Non additività per Il 2 – pyridinecarbox-amidrazone .


Universit di trieste e padova ingegneria chimica

4.3 .2Risultati-ll Computazionale

M.Tuberculosis

  • Concordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibrio dalla dimanica molecolare di composti doccati nel sito attivo

2C

2L


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4.3.2Risultati–Il Computazionale

C.Albicans

  • Concordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibriodalla dimanica molecolare di composti doccati nel sito attivo

2C

2L


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4.3.2Risultati–Il Computazionale

M.Tuberculosis–(kcal/mol)

C.Albicans – (kcal/mol)


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4.4 Conclusione

Concordanza fra dati calcolati e sperimentali

L’evidenza computazionale con i dati sperimentali è utile per il design di nuovi inibitori Azolici


Universit di trieste e padova ingegneria chimica

4.4 Conclusione

I risultati di tale lavoro sono publicati nel seguente articolo : “Antifungal and antimycobacterial activity of new imidazole and triazole derivates. A combined and computational approach”.Journal of Antimicrobial Chemotherapy., July (2006); vol 58, pp. 76 – 84;

Collaborazioni:

Laboratorio di Microbiologia , Dipartimento di Scienze Biomediche e Dipartimento di Scienze Farmaceutiche di Trieste


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Concludendo

Goal:

E’Stata fornita

Una Chiave Razionale – Computazionale

Per interpretare e predire il funzionamento delle proteine coinvolte in patologie generali e virali.

La modellistica molecolare integrata all’analisi clinica è un valido strumento per la ricerca nel campo

medico-farmaceutico .


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Ringraziamenti

Dott.ssa Mestroni L.

Prof.ssa Mamolo M.G.

Prof.ssa Banfi E.

Prof. Vio L.

Prof. La Colla P.

Prof. Di Santo R.

Prof. Manfredini S.

Idenix - Novartis

Staff del MOSE-CASLAB