银杏传粉生物学的观察研究 Observation on the biology of pollination in Ginkgo biloba L.

1. 银杏传粉生物学的观察研究 Observation on the biology of pollination in Ginkgo biloba L. 研 究 生 : 陆 彦 专 业 : 植 物 学 指导教师 : 陈鹏教授

2. 一、研究的目和意义 植物界基本类群 低等植物： 菌类 藻类 地衣 高等植物： 苔藓植物 蕨类植物 裸子植物 被子植物 • 银杏在裸子植物系统演化中的地位 裸子植物(Gymnosperm)：是介于蕨类植物和被子植物之间的一类较为古老的植物，既保留着蕨类植物所具有的颈卵器，又能够产生繁殖后代的种子，这类植物既具有原始的生殖特性又在长期的环境选择中具有演化的性状。因此裸子植物生殖生物学研究一直以来是植物系统演化研究的热点。 苔藓植物的颈卵器

3. 现存的裸子植物可分为11科、71属，约800种。 01. 苏铁科　Cycadaceae 02. 银杏科　Ginkgoaceae 03. 南洋杉科　Araucariaceae 04. 松科　Pinaceae 05. 杉科　Taxodiaceae 06. 柏科　Cupressaceae 07. 罗汉松科　Podocarpaceae 08. 三尖杉科(粗榧科) Cephalotaxaceae 09. 红豆杉科(紫杉科)Taxaceae 10. 麻黄科　Ephedraceae 11. 买麻藤科(倪藤科)Gnetaceae 最古老的种子植物 按照系统演化的顺序排列

4. 银杏(Ginkgo biloba L.)，有研究表明银杏生殖方式和胚胎发育比较原始，并和苏铁类植物较为类似；近年来从分子系统学研究认为有些细胞器（叶绿体和线粒体）基因rbcL序列和核糖体核酸rRNA序列同样说明银杏同苏铁的近似程度超过与松柏类植物。因此许多植物分类学家将银杏与苏铁同时称为最古老的种子植物。 苏铁种子 银杏种子

5. 通过对银杏化石的研究表明，早在古生代银杏（距今3.8亿年）就在地球上出现了，由侏罗纪（距今1.8亿年）向白垩纪（距今约1.3亿年）过渡时期除了南北极地区以外几乎遍布地球，为银杏家族的黄金时代。通过对银杏化石的研究表明，早在古生代银杏（距今3.8亿年）就在地球上出现了，由侏罗纪（距今1.8亿年）向白垩纪（距今约1.3亿年）过渡时期除了南北极地区以外几乎遍布地球，为银杏家族的黄金时代。 银杏 银杏 侏罗纪时期银杏在地球上的分布 白垩纪时期的银杏

6. 第三纪(Tertiary)末期及第四纪(Quatrernary)初期：（距今2500万年～300万年）北半球发生巨大的冰川，因之地球上的植被也发生了根本性的变化，银杏类植物在欧洲和北美的广大地区全部灭绝，在亚洲也濒临绝种。第三纪(Tertiary)末期及第四纪(Quatrernary)初期：（距今2500万年～300万年）北半球发生巨大的冰川，因之地球上的植被也发生了根本性的变化，银杏类植物在欧洲和北美的广大地区全部灭绝，在亚洲也濒临绝种。 但我国冰川不是连成大片覆盖地面的，当时部分地区受到的侵蚀作用比较小，银杏仅在我国得以幸存下来。 “诺亚方舟”

7. 目前银杏（Ginkgo biloba L.）仅以一科（Ginkgoaceae）一属（Ginkgo）一种（G. biloba）作为银杏目的唯一生存种孑遗在我国。由于银杏起源历史久远，在植物的系统演化上位于蕨类植物之后、绝大部分种子植物之前（仅次于苏铁），是植物界重要的“活化石”，被认为是最古老的裸子植物。因此银杏从传粉到受精的整个过程保留了许多古老的原始特征和独特性状，这对于研究裸子植物系统发育起源与种子植物生殖演化都具有重要的理论意义和学术价值。 天目山古银杏树 银杏

8. 传粉生物学研究的重要意义 传粉是种子植物受精的必经阶段，在漫长的发育过程中，不同的植物形成了各自独特的传粉机制。在裸子植物中，花粉大多借助风力进行传播，但有些裸子植物花粉与胚珠分泌的传粉滴有着密切的关系，在松科、杉科、柏科、罗汉松科等植物传粉时都发现有传粉滴的分泌，而对其传粉机制的研究也已有报道。但迄今为止，作为更古老的裸子植物--银杏的传粉过程和传粉机制的研究却仍为空白。为此，近4年来，本课题组对银杏花粉的发育、胚珠的组织分化形成、传粉过程和传粉滴与花粉的相互作用等方面展开了较系统的观察研究。 罗汉松的传粉滴 雪松的传粉滴

9. 二、研究内容、方案及其可行性分析 • 研究内容 1.扬州地区银杏雌雄株开花物候期观察 2.银杏小孢子发生及花粉发育 3.银杏胚珠的形态结构与分化发育 4.银杏传粉过程及传粉机制的观察研究

10. 试验设计方案 银杏雌雄株开花物候期的观察：分别调查不同轮枝层和不同枝龄的雌雄球花量，并对不同枝层和枝龄上花量的分布进行调查；每天观察雌雄球花的形态变化，跟踪记录开花过程；观察授粉滴出现与持续的时间。 小孢子发生和花粉发育:于银杏雄花刚展开至散粉开裂时每天取样，将样品用FAA和戊二醛固定，石蜡切片，荧光显微镜下观察花粉发育过程以及小孢子发育过程中淀粉粒和胼胝体的消长情况；扫描电镜下观察花粉粒的形态大小；超薄切片观察小孢子四分体时期绒占层解体机制以及成熟花粉的结构特征。 胚珠发育的观察:银杏雌球花传粉滴出现之前进行套袋处理，观察其在不传粉的情况下胚珠是否可以正常生长。 胚珠传粉滴产生机理：于胚珠产生授粉滴前期采集胚珠，用戊二醛固定，做超薄切片，透射电镜观察珠心处细胞的结构及细胞器分布特征。

11. 传粉滴产生时间、持续时间及授粉后传粉滴的变化：在实验室内对水培带有胚珠的枝条进行观察，记录传粉滴产生及持续时间。在授粉滴产生后对其授不同的花粉，在体式镜下观察传粉滴消失的过程。传粉滴产生时间、持续时间及授粉后传粉滴的变化：在实验室内对水培带有胚珠的枝条进行观察，记录传粉滴产生及持续时间。在授粉滴产生后对其授不同的花粉，在体式镜下观察传粉滴消失的过程。 花粉和传粉滴成分的分析:大量收集花粉和传粉滴，利用质谱仪测试其成分，从而分析花粉和传粉滴的识别机制。 花粉在传粉滴中的形态变化观察：将授粉滴涂在玻片上，水合作用的观察:然后采集雄株花序，轻轻拍散花粉使其落在授粉滴上，利用光学显微镜录像记录其变化过程，观察传粉滴和花粉的水合作用。 花粉在胚珠体内的运动过程：分别于授粉滴消失后1h、2h、3h、4h、5h、12h、24h采集胚珠，将其纵切并用苯胺蓝染色，荧光显微镜下观察花粉粒在胚珠体内的位置，何时进入贮粉室。

12. 花粉粒在贮粉室中萌发与花粉管生长观察：分别于授粉后5d、6d、 7d、8d、9d、10d采集胚珠，体式镜下观察准确切取贮粉室部位，并用苯胺蓝染色，荧光显微镜下观察花粉的萌发；于授粉后15d、30d、45d、60d、75d、90d、105d、120d、135d采集种实，拨去种皮，挑取带有贮粉室的珠心组织，苯胺蓝染色，荧光显微镜下观察花粉管生长。同时采用扫描电镜法观察花粉萌发与花粉管生长。 颈卵器及帐篷柱发育过程观察：5月底至8月下旬采集银杏胚珠，准确切取部位，戊二醛固定，树脂包埋，做超薄切片观察颈细胞和帐篷柱的超微结构，分析颈细胞的细胞器的结构变化以及帐篷柱是否具有分泌功能。

13. 试验材料 取自扬州大学银杏实验基地内的雄株和雌株佛指品种(G. biloba ‘Fozhi’ )，树龄约为20年，生长发育正常。 银杏雄花发育过程 银杏胚珠发育过程

14. 可行性分析 要完成上述试验，关键在于银杏雌雄花发育时期的确定、裸子植物花粉的保存、传粉滴的收集、测定所需的仪器设备以及研究方法的掌握。对于银杏雌雄花发育过程中各个时期的确定，我们通过4年的大量石蜡、树脂切片及物候期的观察，结合前人的研究结果，已经明确了各个时期的基本过程，以后只要花粉保存完好、能够收集到大量传粉滴、仪器设备完善，即可取得预期结果。

15. 三、研究方法 脱 水 置 换 固 定 半薄切片观察法 包 埋 浸 透 聚 合 切 片 贴 片 修 块 观 察 染 色

16. 超薄切片观察法 脱 水 前固定 后固定 包 埋 渗 透 置 换 观 察 染 色 切 片

17. FAA溶液固定 铁矾媒染 苏木精预染 梯度乙醇脱水 乙醇与二甲苯透明 40 ℃过夜 二甲苯与石蜡渗蜡 展片、粘片、烘片 石蜡包埋 LEICA切片机切片，10 um 乙醇与二甲苯脱蜡 95％乙醇1％伊红复染 中性树胶封片 BH-2型OLYMPUS显微镜观察、拍照 石蜡切片观察法

18. 扫描电镜观察法 取 样 固 定 清 洗 脱 水 置 换 观 察 喷 金 粘 样 临界干燥

19. 体视镜观察法 取鲜样 调 镜 拍 摄

20. FAA溶液固定 梯度乙酮复水 6mol/L NAOH软化 蒸馏水冲洗 苯胺蓝染色 300～400nm荧光显微镜拍照 荧光显微镜观察法

21. 四、课题的创新点 裸子植物大小孢子叶球的发育特征和被子植物的花部性状一样,是研究植物系统学的关键特征之一.银杏的系统演化地位一直是研究的热点,但对银杏大小孢子的发生和结构分化过程尚缺乏系统的观察研究； 裸子植物的传粉机制一直以来是研究的热点,在松科,柏科,杉科等植物上已有报道,但对银杏的相关研究却一直尚未报道; 本试验针对以上两个方面展开系统的观察研究,因此, 具有一定的创新性.

22. 五、研究计划进度、预期进展和预期结果 通过2007-2008两年的大量实验工作，已经取得了这一阶段的预期结果，接下来就是2009-2010两年还要对以下几点进一步研究： 1、小孢子发育过程中淀粉粒和胼胝体的消长情况； 2、传粉滴的形成机理，胚珠珠心组织处分泌细胞的确定； 3、银杏花粉和传粉滴成分的测定分析,以及对其识别蛋白的研究； 4、花粉粒在胚珠体内运动过程，花粉萌发方式； 5、颈细胞超微机构变化和帐篷柱分泌功能的观察； 6、精细胞的化学状态。

23. 六、研究基础和进展 1986年，日本学者Hirase发现了银杏的游动精子，为银杏的研究做出了跨时代的贡献，从此，对银杏的生活史，活体及离体条件下雌雄配子体的发生、发育，受精作用，胚胎发育及系统学地位进行了大量的研究。但目前为止，涉及到银杏传粉方面的研究较少，主要定留在花粉形态、大小，大孢子的发生和贮粉室的形成等方面，还尚未对银杏传粉生物学进行全面系统的研究，因此本实验室对银杏的传粉生物学进行了详细的研究。现已取得如下结果：

24. 1 扬州地区银杏雌雄株开花物候期观察 1.1 花的形态特征 银杏为单性花，雌雄异株，花芽均为混合芽。雄花芽的中间为3-7个叶原基，周围为5-9个花原基，外有芽鳞包被。3月中旬芽鳞逐渐展开,雄花开放，簇生于多年生短枝上，每个小孢子叶由孢囊梗和多个小孢子囊组成。 小孢子囊 主柄 花原基 叶片 叶原基 小孢子叶 短枝

25. 授粉滴 雌花芽的中间一般有2-5个花原基，周围有5-7个叶原基，外有芽鳞包被，4月初芽鳞逐渐展开雌花开放，簇生于多年生短枝上，每个大孢子叶由裸露的胚珠和珠柄组成，每个珠柄上着生1-2个直立胚珠。 胚珠 珠托 珠柄 花原基 叶原基 叶片 大孢子叶 短枝

26. 1.2 开花物候期观察 对于银杏雌雄株开花物候期连续2年的观察由表1可知，银杏雄花约比雌花提前8 d开放，且雄花进入盛花期的时间亦较早，但雄花的散粉期与雌花传粉滴产生的时期相一致，且2者持续时间均较长，其中雄花持续约10 d而雌花持续约7 d ,花期可遇。整株雄花开放的时间较长约为30 d，雌花的开放时间较短约为18 d。单朵花开放时间雄花长于雌花。银杏雄株每根枝条上约有100个以上的雄花序，雄花数量多，易于被风传送。 表1 银杏雌雄株开花进程

27. 2 银杏小孢子发生和花粉发育 2.1 银杏小孢子叶球的形态特征 2.2 银杏小孢子囊壁发育 2.3 银杏小孢子发育 2.4 银杏花粉的发育 2.5 银杏小孢子囊开裂沟的形成与花粉散出 3月26日雄花 3月29日雄花 4月6日雄花

28. 图版I 　银杏小孢子囊结构特征图 1：雄花芽 2：花原基产生 3：小孢子囊原基 4：小孢子囊 5-6：短枝上的雄花 FB: 雄花芽 Sp : 花序原基 Pr : 小孢子囊原基 Sg : 小孢子囊 MF: 雄花

29. 图版II　银杏小孢子囊壁结构特征图 7：小孢子囊 8：1月5日囊壁组织 9：2月囊壁组织 10：3月囊壁组织 11：4月囊壁组织 12：散粉期囊壁组织 Sg : 小孢子囊 ST : 造孢细胞 ML: 中层 E: 表皮 T: 绒毡层

30. 图版III　银杏小孢子囊绒毡层的结构特征图 13：1月5日绒毡层 14：2月绒毡层 15：二分体时期绒毡 层 16：四分体时期绒毡 层 17：小孢子期绒毡层 18：花粉成熟期绒毡层 ST ST mmc T: 绒毡层 ST : 造孢组织 Mmc:小孢子母细胞 Te:四分体 P：花粉粒 Te P P

31. 图版IV银杏小孢子的发生 19：造孢组织细胞 20：小孢子母细胞 21：二分体 22：四分体 23：四分体前期 24：四分体后期 ST: 造孢组织 Mmc:小孢子母细胞 D:二分体 Te:四分体

32. 26：二分体时期囊腔内淀粉粒 27：四分体时期囊腔内淀粉粒 28：释放出的小孢子 29：小孢子第一次分裂 30：小孢子第二次分裂 31：成熟花粉粒 图版V　银杏花粉的发育 S : 淀粉粒 D : 二分体 Te: 四分体 M: 小孢子 P : 花粉

33. 图版VI　银杏小孢子囊开裂沟的形成过程 32-33：造孢细胞期的开裂沟 34：小孢子母细胞期的开裂沟 35-36：小孢子分裂期的开裂沟 37：花粉成熟期的开裂沟 ST: 造孢细胞 DL: 开裂沟 D : 二分体 Te: 四分体 mmc: 小孢子母细胞 P : 花粉

34. 小孢子囊 开裂口 花粉 花粉 银杏单个小孢子囊开裂过程观察

35. 小 结 • 银杏在花粉发育过程、形态等方面的结构特征： • 造孢组织发育较早，且持续时间较长，并以这个阶段进行休眠越冬； • 3月份小孢子母细胞形成，并很快进入减数分裂期，其分裂方式为胞质分裂同时型； • 分裂所形成的四分体为四面体； • 有丝分裂过程表现出明显的极性分裂特征； • 成熟花粉为4细胞具巨大萌发区,花粉粒中有一些淀粉粒的积累，这些淀粉粒主要集中在管细胞区，这些碳水化合物的积累很可能与花粉管的生长及花粉的寿命有关。 造胞组织 雄花芽 二分体 四分体

36. 3 银杏胚珠的形态结构与分化发育 3.1 银杏大孢子的发生 3.2 银杏胚珠珠孔的形成 3.3 银杏胚珠贮粉室的形成与结构变化 3.4 银杏大孢子母细胞的发生 3月26日雌花芽 3月20日雌花芽 4月6日雌花 3月29日雌花

37. 珠心 珠被原基 叶原基 珠心逐渐形 成 胚珠原基 1 2 4 3 珠心 珠心 珠被 珠托 珠孔道 珠被 8 7 6 5 1. 雌花芽内的胚珠原基和叶原基×100; 2.. 珠被原基出现×200; 3-6. 珠被中部分化出珠心组织×250, 250 , 250 , 250; 7 珠孔道逐渐形成×250; 8. 珠托组织形成×152。 Fig.1. The leaf primordium and the ovule primordium in the female flower bud ×100; Fig.2. Integument primordium occured×200; Fig.3-6. Nucellar tissue differentiation from the center of integument×250 , 250 , 250 , 250; Fig.7. Fig.8. Formation of ovule bracket ×152. 扫描电镜观察表明：12月在雌花芽中苞片的基部内侧已分化形成胚珠原基，外侧则分化出叶原基。1月胚珠原基向上突起形成1直立主柄原基。之后主柄原基顶端膨大并形成2歧状的分支状的珠被。3月中旬，在珠被的中部分化形成珠心组织，之后珠心周围的珠被组织继续快速向上增长逐渐包围珠心。3月底在胚珠与珠柄连接的地方迅速膨大形成了珠托。

38. 珠孔形成处 珠孔 珠孔 珠孔 珠孔 19 18 15 16 17 珠孔 珠被 珠孔 珠孔 珠孔 珠孔 20 授粉期 21 22 23 15. 3月20日珠孔尚未形成×400; 16-21. 3月20日至4月6日珠孔形成并逐渐变大×400, ×400, ×400, ×400, ×400 ,×400,; 22. 授粉后珠孔逐渐闭合×400; 23. 授粉期胚珠×50; Fig.15. On March 20 Micropylar unformation ×400; Fig.16-21. From March 20 to April 6 Micropylar formation and beginning to enlarge ×400, ×400, ×400, ×400, ×400 , ×400; Fig.22. Micropylar beginning to close after pollination ×400; Fig.23. Ovule at the stage of pollination ×50. 3月下旬胚珠各组织分化完全后，珠被在珠心的顶端向心生长并逐渐合拢，此时珠孔尚未形成。之后珠孔逐渐开张，在授粉期达到最大，并呈漏斗状。授粉结束后随着珠被的继续生长而闭合。

39. 珠心 珠心 珠心 珠心 24 25 26 27 贮粉室 贮粉室开口 贮粉室开口 珠心 花粉粒 28 29 30 31 24. 珠心组织液泡化×400; 25. 珠心组织逐渐溶解，形成空腔×400; 26-28. 空腔逐渐增大，只剩最上面一层表皮细胞×400; 29-31. 贮粉室形成×400, ×214, ×214。 Fig.24. Nucellar tissue vacuole ×400; Fig.25. Nucellar tissue disorganizes generally and forms a cavum ×400; Fig.26-28. The cavum becomes bigger and bigger and remain the last epidermal cell ×400, ×400, ×400; Fig.29-31. Formation of pollen chamber ×400×214，×214. 随着胚珠的发育,珠心组织顶端细胞开始解体死亡并形成空腔，授粉前空腔顶端的表皮细胞分离，形成了1个开口向上的瓶状结构即为贮粉室。贮粉室在胚珠发育期间，其开口逐渐增大，在胚珠分泌传粉滴时期，开口由线性变为椭圆形，贮粉室的开口正对着珠孔道。

40. 大孢子母细胞 32. 3月20日孢原细胞形成×1000; 33--34. 孢原细胞纵向伸长, 细胞核向珠孔端移动×1000, ×1000; 35--36. 3月28日发育成大孢子母细胞×1000, ×1000; 37. 4月6日成大孢子母细胞的细胞核继续向珠孔端移动×1000; 38. 4月11日形成功能大孢子×1000。 Fig.32. On March 20 formation of archesporium ×1000; Fig.33-34. Archesporium elongation and nucleolus moving to micropylar ×1000, ×1000; Fig.35-36. On March 28 formation of megasporocyte ×1000, ×1000; Fig.37. On April 6 nucleolus of megasporocyte moving to micropylar×1000; Fig.38. On April 11 formation of functional megaspore ×1000. 大孢子母细胞 胞原细胞 32 33 34 四分体 38 37 36 35 珠心组织内分化形成孢原细胞，之后孢原细胞不进行分裂，其体积沿胚珠的纵轴方向伸长，逐渐形成了长椭圆形的细胞，随着孢原细胞的进一步伸长，体积进一步增大，逐渐转变为大孢子母细胞。授粉前大孢子母细胞进入减数分裂期并形成直立的四分体，4细胞中靠近珠孔端的3个细胞逐渐退化消失，而合点端的细胞发育为功能大孢子。

41. 小 结 • 银杏胚珠发育与组织分化的结构特征。 • 银杏胚珠的分化过程为主柄-珠被-珠心-珠托,组织分化的关键期为3月中旬； • 大孢子母细胞是由胞原细胞逐渐伸长而形成的； • 4月初大孢子母细胞经减数分裂形成直立的四分体，4细胞中的靠近珠孔端3细胞退化，而靠近合点端的细胞发育为功能大孢子。 • 授粉前胚珠接受花粉的通道已分化形成,珠孔开张达最大易于接受更多花粉,珠孔道细胞程光滑的长管状可减少花粉的摩擦,贮粉室开口形成并具备停留花粉的功能。 珠心 珠被 珠托 胞原细胞 珠被组织 珠心组织 珠托组织 四分体

42. 4 银杏传粉过程与传粉机制的观察研究 5/4 6/4 7/4 9/4 9/4 8/4 银杏胚珠授粉滴产生时间

43. 10/4 11/4 11/4 13/4 13/4 12/4 银杏胚珠授粉滴消失时间

44. (时间)9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 (时间) 14:30 15:30 17:00 18:30 20:00 离体条件下未授粉处理授粉滴的形态变化

45. 花粉 (时间)11:30 12:00 12:30 13:00 13:30 (时间) 14:00 14:30 15:00 15:30 16:30 授于银杏花粉后授粉滴的形态变化

46. 苏铁花粉 (时间)9:30 9:45 10:00 10:15 10:30 (时间) 10:45 11:00 11:15 11:30 11:45 12:00 授于苏铁花粉后授粉滴的形态变化 传粉滴由体积最大至消失共需约3h

47. 雪松花粉 (时间)9:30 10:00 10:30 11:00 (时间) 11:30 12:00 12:30 13:00 13:30 授于雪松花粉后授粉滴的形态变化 传粉滴由体积最大至消失共需约4h

48. 白玉兰花粉 授予白玉兰花粉 传粉滴由体积最大至消失共需约5.5h (时间)9:00 9:30 10:00 10:30 13:00 14:00 14:30 牡丹花粉 授予牡丹花粉 传粉滴由体积最大至消失共需约8.5h (时间) 15:00 16:00 18:00 20:00 21:00 22:00 23:30 授于白玉兰 牡丹花粉后授粉滴的形态变化

49. 花粉 花粉 (时间)9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 花粉 (时间) 14:30 15:30 17:00 18:30 20:00 授于被子植物花粉后授粉滴的形态变化

50. 小 结 • 银杏传粉过程及传粉机制特征： • 在传粉期胚珠的珠孔处开始产生传粉滴，传粉滴是由胚珠分泌产生并排到珠孔外形成的，为胚珠的一种代谢活动。胚珠在未授粉的情况下可持续产生传粉滴； • 不同科植物的花粉与银杏传粉滴的水合程度以及引起传粉滴收缩速度不同，其中亲缘关系较近的植物花粉引起传粉滴收缩速率较快，而亲缘关系越远的植物花粉引起传粉滴收缩速率则越慢。