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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer - PowerPoint PPT Presentation


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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico. PCR da mRNA (RT-PCR). Uso dei “linkers”. Vettori dA:dT. 3’. 5’. 3’. 5’. 5’. 3’. 3’. 5’. PCR da DNA genomico. EcoRI. BamHI. EcoRI. BamHI. Proteine di fusione. prom. Tag o rep. term. cDNA. trascrizione

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Presentation Transcript
Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

  • PCR

  • Scelta dello stampo

  • Scelta dei primer


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

PCR da DNA

genomico




Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Vettori dA:dT

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

PCR da DNA

genomico

EcoRI

BamHI

EcoRI

BamHI


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Proteine di fusione

prom

Tag o rep.

term

cDNA

trascrizione

traduzione


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Elettroforesi di acidi nucleici

  • Gel di agarosio

  • Gel di acrilammide





Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Soluzioni di caricamento

  • Aumentano la densità del campione

  • Colorano il campione

  • Rendono visibile la corsa elettroforetica



Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Fattori che influenzano la migrazione

  • Peso molecolare

  • Concentrazione di agarosio

  • Conformazione DNA

  • Voltaggio applicato

  • Intercalanti

  • Tampone di elettroforesi





Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Recupero DNA da gel

  • Elettroeluizione

  • Agarosio “low melting”

  • Solubilizzazione agarosio




Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Metodi di sequenziamento

  • Sanger (enzimatico)

  • Maxam e Gilbert (chimico)


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Metodo di Sanger

primer

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)

DNA polimerasi

ddTTP

ddCTP

ddGTP

ddATP

primer

nuovo DNA

dideossinucleotide

terminatore

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Metodo di Maxam e Gilbert

DNA singolo filamento marcato ad una estremità

32P

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide



Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Fasi di un progetto di sequenziamento

  • clonaggio e preparazione del DNA

  • reazioni di sequenza

  • elettroforesi su gel di poliacrilammide

  • interpretazione e raccolta dati




Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Strategie di sequenziamento

  • Primer specifici consecutivi

  • Delezioni progressive

  • Frammenti casuali (shotgun)