slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Taxonomie PowerPoint Presentation
Download Presentation
Taxonomie

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 40

Taxonomie - PowerPoint PPT Presentation


  • 145 Views
  • Uploaded on

Taxonomie. x 1 , y 1 , z 1 = plesiomofie x 2 = synapomorfie (homologie) pro BCD y 2 = autapomorfie pro B z 2 = homoplázie (konvergence) pro ED. rEKAPITULACE. Jak získáváme znaky pomocí sekvenace unikátních lokusů. Sekvenace lokusu u taxonů, které chceme studovat 1. Přednáška.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Taxonomie' - nijole


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Taxonomie

x1, y1, z1 = plesiomofie

x2 = synapomorfie (homologie) pro BCD

y2 = autapomorfie pro B

z2 = homoplázie (konvergence) pro ED

slide2

rEKAPITULACE

Jak získáváme znaky pomocí sekvenace unikátních lokusů

Sekvenace lokusu u taxonů, které chceme studovat

1. Přednáška

Stažení homologních sekvencí od relevantních taxonů z databáze

2. přednáška

Tvorba alignmentu

3. přednáška

Bude náplní prvního praktika 7. 4 ., B5

slide3

alignment

Mutliple sequence alignment (MSA)

Kontrolní otázka: Co v alignmentu představuje jeden znak?

slide4

Ostatní metody získávání molekulárních dat

Pokud bychom měli k dispozici kompletní genomové sekvence organismů, které chceme studovat, žádné takové metody bychom nepotřebovali. Jenže je nemáme a jejich sekvenování je stále pro větší množství vzorků neprakticky drahé. Následující metody umožňují rychle a často levně získat dostatečné množství dat pro otázky, které v molekulární taxonomii řešíme.

slide5

DNA-DNA hybridizace

  • Stanovit střední teplotu tání homoduplexů
  • Tm= (TmA + TmB)/2
  • Stanovit teplotu tání heteroduplexu -Tms
  • Vypočítat pokles ΔTm
  • ∆Tm=Tm - Tms
  • Vypočítat p (podíl rozdílných nukleotidů)
  • p = ΔTm . 0,01 (0,015)
  • Používá se snad jen v bakterální systematice,
  • za hranici druhu je považován pokles Tmo 30% (~ 5% rozdílu nukleotidů)
v hody

DNA-DNA hybridizace

Výhody
  • Multilokusová (totilokusová) metoda

Nevýhody

  • Distanční metoda
  • Experimentálně dosti náročná
  • Vyžaduje větší množství DNA
  • Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA)
  • Experimentální náročnost N x N
slide7

ORGI (overall genome relatednessindices)

  • Snaha najít jednoduchou míru podobnosti porovnáním celých genomů (v budoucnu nahradí DNA hybridizaci)
  • V současnosti osekvenováno více než 10 000 bakteriálních genomů
  • ANI (average nucleotide identity) – průměrná identita všech homologních úseků rozpoznaných pomocí BLASTN (Goris a kol. 2007) – hranice bakteriálního druhu 95-96%.
  • Frekvence 4 nukleotidových „slov“ (Richter a Rosseló-Móra 2009)
  • GBDP– průměrná genetická vzdálenost vypočtená z celkového alignmentu dvou genomů (Meier-Kolthoff a kol. 2013)– hranice bakteriálního druhu 0,258.
  • MUMi – podíl oblastí s dokonalou shodou na celkové délce porovnávaných genomů (Deloger a kol. 2009).
slide8

IZOENZYMOVá analýza

  • Isozymy– enzymy vykazující stejnou nebo podobnou aktivitu.
  • Alozymy– podmnožina isozymů, alelické formy téhož enzymu (v jednom lokusu)
  • Zymodem -taxonomická jednotka vymezená na podkladě isozymovéhovzoru
princip

IZOENZYMOVá analýza

Princip

Detekce elektroforetickou mobilitou se lišících forem enzymů kódovaných různými alelami určitého genu. Jednotlivé enzymy se detekují prostřednictvím jejich specifické aktivity, většinou pomocí spřažené enzymatické reakce s barevným produktem.

v hody1

IZOENZYMOVá analýza

Výhody
  • Kodominance
  • Množství polymorfismu je vhodné pro vnitropopulačnístudie
  • Znaková metoda
  • Nízká cena analýzy a cena vybavení

Nevýhody

  • Nemusí být selekčně neutrální (mikrosatelityjsoulepší)
  • Konvergence (i různé alozymy mohou mít shodnou elektromobilitu)
  • Omezené množství použitelných enzymů
slide12

Restrikční analýzy

  • Izolace DNA
  • Nastříhání DNA pomocí restrikčních endonukleáz
  • Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich kombinace
  • Problémy s přílišnou komplexitou vzorů
    • Snížení komplexity výchozí DNA
    • Kvalita separace fragmentů
    • Detekce jen určitých zón

EcoRI

slide13

Restrikční analýzy

RFLP bakteriální DNA

Komplexita bakteriálního genomu je nízká, a proto vzniká i méně komplexní vzor, ze kterého je možno odečíst jednotlivé pruhy

Celková DNA po naštěpení rozdělena na PAGE a obarvena EtBr

slide14

Restrikční analýzy

RFLP organelové DNA

Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a obarvena EtBr.

slide15

Restrikční analýzy

mtRFLP – krok 1

Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr

slide16

Restrikční analýzy

mtRFLP – krok 2 – Southern blot

slide17

Restrikční analýzy

mtRFLP – krok 2

DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizovánas mtDNA sondou a detekována autoradiograficky.

slide18

Restrikční analýzy

VNTR – Variable Number of Tantem Repeats

Využívá polymorfismus v počtu kopií tandemových repetic – minisatelitů (10-60 nt). Tento polymorfismus je velmi variabilní i mezi jedinci téhož druhu.

Celkovou DNA naštípeme restrikční endonukleázou, která neštěpí uvnitř minisatelitu. Naštípanou DNA přeblotujeme na membránu a hybridizujeme se značenou próbou proti minisatelitu, pokud chceme zviditelnit všechny lokusy (obrázek v pravo), nebo proti minisatelitua unikátní sekvenci v sousedství,pokud chceme zviditelnit jen jeden lokus (obrázek dole).

slide19

Restrikční analýzy

Výhody

  • Relativní jednoduchost a láce
  • Velké množství dat
  • Slušná reprodukovatelnost
  • Kodominance znaků
  • Multilokusový charakter
  • Selekční neutralita znaků
slide20

Restrikční analýzy

Nevýhody

  • Potřeba většího množství DNA
  • Potřeba kvalitnější a čistší DNA
  • Spíše pro příbuzné druhy
  • Někdy špatně čitelné elektroforetogramy – nutnost snižovat komplexitu DNA
  • Znaky nemusí být nezávislé
  • Spíše distanční metoda
slide21

Mikrosatelity

Mikrosatelity- (nazývané i STR - Short Tandem Repeat) jsou krátké sekvenční motivy (dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se na některých místech genomu v mnoha tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce až 150 jednotek repetice. Průměrně 1x za 1000 generací dochází k mutacím, při kterých se mikrosatelit prodlouží nebo zkrátí obvykle o jednu jednotku repetice. Proto existuje velmi značný vnitropopulační polymorfismus v délce alel a tento polymorfismus můžeme snadno studovat PCR amplifikací daného lokusu.

slide23

Mikrosatelity

Postup při analýze

  • najít vhodný lokus (genomová knihovna a hybridizace nebo vyhledávání v genomových datech)
  • připravit PCR primery ohraničující daný lokus
  • amplifikovat lokus
  • elekroforéza amplifikovaných fragmentů
slide26

Mikrosatelity

Využití metody

  • vnitrodruhové studie či příbuzné druhy
  • kodominance znaků – populační genetika
  • modernější a přesnější varianta alozymové analýzy
  • možno analyzovat velké množství vzorků
  • nákladné pouze zavedení metody pro nové organismy
slide27

RAPD

RandomAmplifiedPolymorphicDNA

  • Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů
  • Různé metody zvyšování počtu znaků
    • Kombinace primerů, restrikce enzymy, semiselektivníprimery (transposomy)
slide28

RAPD

Výhody

  • Cena
  • Rychlost
  • Univerzálnost
  • Malé množství materiálu
  • Nižší požadavky na kvalitu DNA
  • Obrovské (libovolné) množství dat
slide29

RAPD

Nevýhody

  • Neprodukuje věrohodné znaky (mnohofalešných homologií), při analýze je třeba převést na genetické vzdálenosti
  • Použitelné jen u relativně příbuzných druhů
  • Chybí kodominance
  • Interference znaků
    • Vliv kontaminující DNA
  • Nízká reprodukovatelnost PCR
slide30

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

slide31

AFLP

kapilárová elektroforéza

standard molekulární váhy

amplifikované fragmenty

slide32

AFLP

Výhody

  • Vysoká reprodukovatelnost výsledků
  • Velké množství znaků
  • Kodominance znaků
  • Minimum falešných homologií
  • Lze použít znakově orientované metody

Nevýhody

  • Nákladnost kitů i přístrojového vybavení
  • Složitost metody
  • Spíše pro příbuzné druhy
slide33

VYUžitírepetitivní DNA

Repetitivní DNA se vyskytuje na mnoha pozicích v genomu. Poloha těchto DNA elementů se liší i mezi jedinci téhož druhu.

slide34

VYUžitírepetitivní DNA

Varianty RAPD používající jeden nebo oba primery nasedající na konzervativní LTR repetici na koncích LTR retrotranspozonů a polymerace směřuje směrem ven z retrotranspozónu. Zvyšuje se tak reproducibilita metody.

IRAP – oba primery nasedají na LTR

REMAP – druhý primer nasedá na mikrosatelity

R-RAP – druhý primer je náhodný jako u RAPD

slide35

SINE

Short INterspersed repetitive Elements

Retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL RNA (Alu). Velikost: 70-500 PB. Vytvářejí značnou část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na genom. Výhoda pro molekulární fylogenetiku existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného místa vystřihly.

slide36

SINE

Postup

  • Najít nový SINE element: vyhledávání v genomových datech, náhodné sekvenování genomu, skríning genomové knihovny sondou proti SINE.
  • Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u studovaného taxonu.
  • PCR amplifikace vybraného lokusu.
  • Ověření přítomnosti nebo absence SINE sekvenací nebo hybridizací se sondami
slide37

SINE

PCR produkty EtBr

Hybridizace se SINE probou

Hybridizace s okolní unikátní sekvencí

slide38

SINE

Nikaido a kol. 1999

slide39

SINE

Chen a kol. 2011

slide40

SINE

Výhody a nevýhody

  • použitelná pro vyšší taxony (maximálně však 75-100 milionů let
  • málo znaků – není možno počítat délku větví
  • unikátní události malá pravděpodobnost homoplázií, a proto lze data velmi snadno interpretovat
  • Umožňuje polarizovat fylogenezi – víme, že původní stav je nepřítomnost SINE