Taxonomie

1. Taxonomie x1, y1, z1 = plesiomofie x2 = synapomorfie (homologie) pro BCD y2 = autapomorfie pro B z2 = homoplázie (konvergence) pro ED

2. rEKAPITULACE Jak získáváme znaky pomocí sekvenace unikátních lokusů Sekvenace lokusu u taxonů, které chceme studovat 1. Přednáška Stažení homologních sekvencí od relevantních taxonů z databáze 2. přednáška Tvorba alignmentu 3. přednáška Bude náplní prvního praktika 7. 4 ., B5

3. alignment Mutliple sequence alignment (MSA) Kontrolní otázka: Co v alignmentu představuje jeden znak?

4. Ostatní metody získávání molekulárních dat Pokud bychom měli k dispozici kompletní genomové sekvence organismů, které chceme studovat, žádné takové metody bychom nepotřebovali. Jenže je nemáme a jejich sekvenování je stále pro větší množství vzorků neprakticky drahé. Následující metody umožňují rychle a často levně získat dostatečné množství dat pro otázky, které v molekulární taxonomii řešíme.

5. DNA-DNA hybridizace • Stanovit střední teplotu tání homoduplexů • Tm= (TmA + TmB)/2 • Stanovit teplotu tání heteroduplexu -Tms • Vypočítat pokles ΔTm • ∆Tm=Tm - Tms • Vypočítat p (podíl rozdílných nukleotidů) • p = ΔTm . 0,01 (0,015) • Používá se snad jen v bakterální systematice, • za hranici druhu je považován pokles Tmo 30% (~ 5% rozdílu nukleotidů)

6. DNA-DNA hybridizace Výhody • Multilokusová (totilokusová) metoda Nevýhody • Distanční metoda • Experimentálně dosti náročná • Vyžaduje větší množství DNA • Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA) • Experimentální náročnost N x N

7. ORGI (overall genome relatednessindices) • Snaha najít jednoduchou míru podobnosti porovnáním celých genomů (v budoucnu nahradí DNA hybridizaci) • V současnosti osekvenováno více než 10 000 bakteriálních genomů • ANI (average nucleotide identity) – průměrná identita všech homologních úseků rozpoznaných pomocí BLASTN (Goris a kol. 2007) – hranice bakteriálního druhu 95-96%. • Frekvence 4 nukleotidových „slov“ (Richter a Rosseló-Móra 2009) • GBDP– průměrná genetická vzdálenost vypočtená z celkového alignmentu dvou genomů (Meier-Kolthoff a kol. 2013)– hranice bakteriálního druhu 0,258. • MUMi – podíl oblastí s dokonalou shodou na celkové délce porovnávaných genomů (Deloger a kol. 2009).

8. IZOENZYMOVá analýza • Isozymy– enzymy vykazující stejnou nebo podobnou aktivitu. • Alozymy– podmnožina isozymů, alelické formy téhož enzymu (v jednom lokusu) • Zymodem -taxonomická jednotka vymezená na podkladě isozymovéhovzoru

9. IZOENZYMOVá analýza

10. IZOENZYMOVá analýza Princip Detekce elektroforetickou mobilitou se lišících forem enzymů kódovaných různými alelami určitého genu. Jednotlivé enzymy se detekují prostřednictvím jejich specifické aktivity, většinou pomocí spřažené enzymatické reakce s barevným produktem.

11. IZOENZYMOVá analýza Výhody • Kodominance • Množství polymorfismu je vhodné pro vnitropopulačnístudie • Znaková metoda • Nízká cena analýzy a cena vybavení Nevýhody • Nemusí být selekčně neutrální (mikrosatelityjsoulepší) • Konvergence (i různé alozymy mohou mít shodnou elektromobilitu) • Omezené množství použitelných enzymů

12. Restrikční analýzy • Izolace DNA • Nastříhání DNA pomocí restrikčních endonukleáz • Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich kombinace • Problémy s přílišnou komplexitou vzorů • Snížení komplexity výchozí DNA • Kvalita separace fragmentů • Detekce jen určitých zón EcoRI

13. Restrikční analýzy RFLP bakteriální DNA Komplexita bakteriálního genomu je nízká, a proto vzniká i méně komplexní vzor, ze kterého je možno odečíst jednotlivé pruhy Celková DNA po naštěpení rozdělena na PAGE a obarvena EtBr

14. Restrikční analýzy RFLP organelové DNA Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a obarvena EtBr.

15. Restrikční analýzy mtRFLP – krok 1 Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr

16. Restrikční analýzy mtRFLP – krok 2 – Southern blot

17. Restrikční analýzy mtRFLP – krok 2 DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizovánas mtDNA sondou a detekována autoradiograficky.

18. Restrikční analýzy VNTR – Variable Number of Tantem Repeats Využívá polymorfismus v počtu kopií tandemových repetic – minisatelitů (10-60 nt). Tento polymorfismus je velmi variabilní i mezi jedinci téhož druhu. Celkovou DNA naštípeme restrikční endonukleázou, která neštěpí uvnitř minisatelitu. Naštípanou DNA přeblotujeme na membránu a hybridizujeme se značenou próbou proti minisatelitu, pokud chceme zviditelnit všechny lokusy (obrázek v pravo), nebo proti minisatelitua unikátní sekvenci v sousedství,pokud chceme zviditelnit jen jeden lokus (obrázek dole).

19. Restrikční analýzy Výhody • Relativní jednoduchost a láce • Velké množství dat • Slušná reprodukovatelnost • Kodominance znaků • Multilokusový charakter • Selekční neutralita znaků

20. Restrikční analýzy Nevýhody • Potřeba většího množství DNA • Potřeba kvalitnější a čistší DNA • Spíše pro příbuzné druhy • Někdy špatně čitelné elektroforetogramy – nutnost snižovat komplexitu DNA • Znaky nemusí být nezávislé • Spíše distanční metoda

21. Mikrosatelity Mikrosatelity- (nazývané i STR - Short Tandem Repeat) jsou krátké sekvenční motivy (dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se na některých místech genomu v mnoha tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce až 150 jednotek repetice. Průměrně 1x za 1000 generací dochází k mutacím, při kterých se mikrosatelit prodlouží nebo zkrátí obvykle o jednu jednotku repetice. Proto existuje velmi značný vnitropopulační polymorfismus v délce alel a tento polymorfismus můžeme snadno studovat PCR amplifikací daného lokusu.

22. Mikrosatelity

23. Mikrosatelity Postup při analýze • najít vhodný lokus (genomová knihovna a hybridizace nebo vyhledávání v genomových datech) • připravit PCR primery ohraničující daný lokus • amplifikovat lokus • elekroforéza amplifikovaných fragmentů

24. Mikrosatelity

25. Mikrosatelity

26. Mikrosatelity Využití metody • vnitrodruhové studie či příbuzné druhy • kodominance znaků – populační genetika • modernější a přesnější varianta alozymové analýzy • možno analyzovat velké množství vzorků • nákladné pouze zavedení metody pro nové organismy

27. RAPD RandomAmplifiedPolymorphicDNA • Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů • Různé metody zvyšování počtu znaků • Kombinace primerů, restrikce enzymy, semiselektivníprimery (transposomy)

28. RAPD Výhody • Cena • Rychlost • Univerzálnost • Malé množství materiálu • Nižší požadavky na kvalitu DNA • Obrovské (libovolné) množství dat

29. RAPD Nevýhody • Neprodukuje věrohodné znaky (mnohofalešných homologií), při analýze je třeba převést na genetické vzdálenosti • Použitelné jen u relativně příbuzných druhů • Chybí kodominance • Interference znaků • Vliv kontaminující DNA • Nízká reprodukovatelnost PCR

30. AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

31. AFLP kapilárová elektroforéza standard molekulární váhy amplifikované fragmenty

32. AFLP Výhody • Vysoká reprodukovatelnost výsledků • Velké množství znaků • Kodominance znaků • Minimum falešných homologií • Lze použít znakově orientované metody Nevýhody • Nákladnost kitů i přístrojového vybavení • Složitost metody • Spíše pro příbuzné druhy

33. VYUžitírepetitivní DNA Repetitivní DNA se vyskytuje na mnoha pozicích v genomu. Poloha těchto DNA elementů se liší i mezi jedinci téhož druhu.

34. VYUžitírepetitivní DNA Varianty RAPD používající jeden nebo oba primery nasedající na konzervativní LTR repetici na koncích LTR retrotranspozonů a polymerace směřuje směrem ven z retrotranspozónu. Zvyšuje se tak reproducibilita metody. IRAP – oba primery nasedají na LTR REMAP – druhý primer nasedá na mikrosatelity R-RAP – druhý primer je náhodný jako u RAPD

35. SINE Short INterspersed repetitive Elements Retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL RNA (Alu). Velikost: 70-500 PB. Vytvářejí značnou část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na genom. Výhoda pro molekulární fylogenetiku existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného místa vystřihly.

36. SINE Postup • Najít nový SINE element: vyhledávání v genomových datech, náhodné sekvenování genomu, skríning genomové knihovny sondou proti SINE. • Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u studovaného taxonu. • PCR amplifikace vybraného lokusu. • Ověření přítomnosti nebo absence SINE sekvenací nebo hybridizací se sondami

37. SINE PCR produkty EtBr Hybridizace se SINE probou Hybridizace s okolní unikátní sekvencí

38. SINE Nikaido a kol. 1999

39. SINE Chen a kol. 2011

40. SINE Výhody a nevýhody • použitelná pro vyšší taxony (maximálně však 75-100 milionů let • málo znaků – není možno počítat délku větví • unikátní události malá pravděpodobnost homoplázií, a proto lze data velmi snadno interpretovat • Umožňuje polarizovat fylogenezi – víme, že původní stav je nepřítomnost SINE