Mrna metabolism
Download
1 / 67

mRNA metabolism - PowerPoint PPT Presentation


  • 171 Views
  • Uploaded on

mRNA metabolism. CAP. m 7 G CAP lisatakse kõigile RNA pol II produktidele, osadel protsessitakse hiljem maha. mRNA snRNA snoRNA Telomeraasi RNA. CAPi funktsioonid tuumas (kompleksis CBC-ga). mRNA splaisingu aktiveerimine tuumas mRNA 3´-otsa protsessimise/ polüadenülatsiooni aktivatsioon

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' mRNA metabolism' - nhi


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
Mrna metabolism

mRNAmetabolism



M 7 g cap lisatakse k igile rna pol ii produktidele osadel protsessitakse hiljem maha
m7G CAP lisatakse kõigile RNA pol II produktidele, osadel protsessitakse hiljem maha

  • mRNA

  • snRNA

  • snoRNA

  • Telomeraasi RNA


Capi funktsioonid tuumas kompleksis cbc ga
CAPi funktsioonid tuumas (kompleksis CBC-ga)

  • mRNA splaisingu aktiveerimine tuumas

  • mRNA 3´-otsa protsessimise/ polüadenülatsiooni aktivatsioon

  • snRNAde tuuma-tsütoplasma-tuuma transport


Capi funktsioonid ts toplasmas
CAPi funktsioonid tsütoplasmas

  • Toob ribosoomid mRNA-le (üle eIF4F kompleksi). See on translatsiooni kiirust limiteeriv etapp.

  • Kaitseb 5´-3´ suunalise mRNA eksonukleolüütilise lagundamise eest. PABP interaktsioon CAP-ga selleks vajalik.


Snrnade edasi tagasi liigutamine
snRNAde edasi tagasi liigutamine

  • m7G CAP eksporditakse tuumast tsütoplasmasse

  • Seal toimub m7G topeltmetüleerimine 2. positsioonist trimetüülguanosiin süntaas 1 (Tgs1) poolt

  • m2,2,7G imporditakse tuuma tagasi

  • m2,2,7G hoiab RNA tuumas


Mrna stabiilsus

mRNA stabiilsus

Inimese rakkudes on enamusi mRNAsid u 6 koopiat raku kohta, vaid väheseid 50-100 koopiat.

mRNA stabiilsused varieeruvad alates 100X rakutsüklist lühemast poolestusajast kuni mitme rakutsükli pikkuseni.

Paljude mRNAde poolestusajad on reguleeritavad.

mRNA stabiilsused:

varase vastuse geenid (proto-onkogeenid, tsütokiinid) 10-60 min;

majahoidjad (histoonid, hormoonid) u 12 h

globiinid, müosiinid, IgG u 24 h.

mRNAd siduvad valgud:

1-globaalsed (PABP)

2-grupispetsiifilised (ELAV/Hu)

3-tüübispetsiifilised (IRE).

Pärmis 471 annoteeritud RNA-seostuvat valku, millest 312 osalevad RNA protsessingus, modifitseerimistes, splaisingus või lagundamises.

Inimeses võib-olla ca 1500 RNA-siduvat valku; palju neist ei tea.

Inimeses 30 põhilist hnRNP valku ja palju minoorseid.


Mrna lagundamine eukar ootides
mRNA lagundamine eukarüootides

  • 5´ 3´ lagundamine tsütoplasmas

  • 3´ 5´ lagundamine tsütoplasmas

  • ARE elemendid- mRNA destabiliseerimine

  • Lagundamine tuumas

  • Lagundamine endonukleaasi poolt

  • NSD- nonstop mediated decay (3´-5´)

  • NMD- nonsense mediated decay


Mechanisms of mRNA turnover

Wagner, E. et al. J Cell Sci 2002;115:3033-3038


5 3 lagundamine
5´ 3´ lagundamine

  • mRNA deadenüleerimine 10-15 A-ni (Pop2-Ccr4 kompleks, Pan2-Pan3 kompleks, PARN)

  • CAPi mahavõtmine (Dcp2-Dcp1 kompleks)

  • 5´-3´ lagundamine exonukleaasi Xrn1 poolt


Pol a saba ja degradatsioon
polüA saba ja degradatsioon

  • polüA seob valku PABP

  • PABP interaktsioon polüA sabaga inhibeerib mRNA degradatsiooni (CAP’i eemaldamist)

  • polüA saba pole vajalik decappimise inhibeerimiseks

  • Deadenüleeriv ensüüm PARN seondub 5´ CAP’le, see stimuleerib aktiivsust.

  • Oletatavasti on polüA eemaldamise tingimuseks normaalse mRNA tsirkulariseerimise muutus või kadumine.


  • translatsiooni initsatsiooni inhibitsioon destabiliseerib mRNAd

  • elongatsiooni inhibitsioon stabiliseerib mRNAd

  • PAB1 mutatsiooni viivad enneaegseledecappimisele

  • Mutatsioonid, mis vähendavad decappimist, supresseerivad pab1 deletsiooni letaalsust.

  • eIF4E ja 4G mutatsioonid tõstavad deadenülatsiooni ja decappimist.

  • Dcp1 seob eIF4G-d


Kuidas pabp kaitseb cap i
Kuidas PABP kaitseb CAP’i mRNAd

  • mRNAd stabiliseeriv ja eIF faktoreid siduvad regioonid erinevad

  • Valgusünteesi initsiatsioonist sõltumatud PABPi kontaktid CAP’ga

  • Decappimise inhibitsioon läbi lokalisatsiooni (P body vs. translating ribosomes)


Mrna decaping

mRNA mRNAd “decaping”

polüA lühenemine või eemaldamine

mRNA translatsioon peab olema lõppenud

mRNA lokaliseeritakse nn. P “body”sse

toimub CAP’i eemaldamine


3 5 lagundamine
3´ 5´ lagundamine mRNAd

  • PolüA lagundamine (PARN)

  • Tsütoplasmaatiline eksosoom (vähemalt 9 eksonukleaasi) sööb CAPiga mRNA

  • DcpS hävitab CAP-i järelejäänud lühikese (alla 10 nt) mRNA jupi otsast


Imetajate eksosoom koosneb minimaalselt
Imetajate eksosoom koosneb minimaalselt: mRNAd

  • 6st RNaas-PH-domääni valgust (PM/SCL75, MTR3, RRP41, RRP42, RRP43 ja RRP46)

  • 3st S1 ja KH domääni valgust (RRP4, RRP40,CSL4)

  • RNaasD-sarnasest PM/SCL100

  • Helikaas (?) KIAA0053

  • Valgust, mida rakutsükli M faasis fosforüülitakse


Are mrnad
ARE mRNAd mRNAd

A+U rikas element ARE paljude ebastabiilsete mRNAde 3´-UTRs.

3´-5´ degradatsioonirada põhiline.

8% inimese mRNA-dest sisaldavad ARE elemente. Ei ole selge kuidas ARE-siduvad valgud töötavad.


Are siduvad valgud
ARE-siduvad valgud mRNAd

  • AUF1 – destabiliseerib/ kuumaehmatusel stabiliseerib

  • HuR – stabiliseerib ARE-mRNAd, reguleerib nende tuumaeksporti ja lokalisatsiooni tsütoplasmas

  • TTP, KSRP, BRF1 - destabiliseerivad


Model for how the A+U-rich element mediates stability and instability.   Interaction of the A+U-rich element (ARE) with a destabilizing factor, such as AUF1, might promote rapid deadenylation by reducing the affinity of the poly(A) binding protein (PABP) for the poly(A) tail. Conversely, stabilizing factors, such as HuR, might enhance binding of the PABP to the poly(A) tail, thus blocking deadenylation.


Mrna endonukleol tiline lagundamine
mRNA endonukleolüütiline lagundamine instability.

  • PMR1- polysomal ribonuclease 1 vahendab östrogeeni poolt stimuleeritud üldist seerumivalkude mRNAde degradatsiooni Xenopuse ootsüüdis.

  • Tunneb ära AYUGA järjestust.

  • Osaleb ka NMDs erütrotsüüdis (β-globiini mRNA)


Mrna lagundamine tuumas
mRNA lagundamine tuumas instability.

  • Tuuma eksosoom 3´-5´- unikaalne komponent Rrp6p (pärm). Vajalik snRNA, rRNA, snoRNA, pre-mRNA maturatsiooniks ja RNA degradatsiooniks tuumas.

  • Rrp6p osaline kvaliteedikontrollil värskelt sünteesitud mRNA vabastamisel transkriptsioonikohast.

  • Ka tuumaeksosoom võib ARE-mRNAd lagundada


Nsd nonstop mediated decay
NSD- nonstop mediated decay instability.

  • Polü(A) translatsioon lisab valgule polü(Lys) saba

  • Ribosoom jääb otsa kinni, seob Ski7 (eRF3 homoloog)

  • Ski7 stimuleerib ribosoomi dissotsatsiooni ja toob eksosoomi kohale


Nmd nonsense mediated decay toimub k igis eukar ootides
NMD- nonsense mediated decay instability. toimub kõigis eukarüootides

  • Enneaegsete stop-koodonitega mRNAd

  • Upstream ORF in 5´UTR

  • Liiga pikk 3´UTR

  • Bitsistroonsed mRNAd

  • mRNAd kus kasutatakse korraga mitmeid eri raamides start koodoneid


Nmd on t htis protsess
NMD on tähtis protsess instability.

  • 10% pärmi mRNAde tase muutub kui NMD-d inhibeerida

  • 1/3 imetaja alternatiivsest splaisingust toodab NMD substraate

  • NMDs inaktiivsed hiire embrüod surevad varsti pärast implantatsiooni

  • NMDs inaktiivsed blastotsüstid lähevad kultuuris apoptoosi


Miks NMD? instability. Pooliku ORFiga mRNAlt peaks transleeritama poolikut valku. Poolikud valgud, mis näiteks on jäänud ilma olulistest domäänidest võivad kahjustada organismi elutegevust töötades näiteks onkogeenidena või viies dominantselt negatiivsele fenotüübile. On teada üle 200 enneaegset stop-koodonit tekitava mutatsiooni, mis põhjustavad haigusi (enneaegse stop-koodoni tekkele viib ka enamus raaminihet põhjustavaid mutasioone). Kui NMD-d ei oleks, oleksid paljud retsessiivsed mutatsioonid dominantse mõjuga (ja põhjustaksidraskemaid haigusi).


Nmd kohta 2 olulist fakti
NMD kohta 2 olulist fakti: instability.

1) NMD toimub enamasti enne kui on katkenud mRNA füüsiline side tuumaga. Enneaegset stop-koodonit sisaldav mRNA molekul, mis juba ilusti tsütoplasmas ujub, pääseb suure tõenäosusega lagundamisest.


2) NMD on alati seotud lagundatava mRNA translatsiooniga. Enneaegset stop-koodonit sisaldava mRNA translatsiooni inhibeerimine stabiliseerib vastavat mRNAd. Konkreetselt on NMD toimumiseks vajalik translatsiooni terminatsioon enneaegsel stop-koodonil (supressor-tRNAd inhibeerivad NMD-d).


Translatsioon, mille toimumisest NMD sõltub, initseeritakse sõltuvalt tuumas cap-i siduvatest valkudest CBP80 ja CBP20. Kuna juba peale esimest translatsioonitsüklit vahetatakse need valgud mRNA 5´-cap struktuuril eIF4E vastu, toimub NMD peale esimest ja enne teist translatsioonitsüklit.


Imetajas on NMD toimumiseks vaja, et stop koodononile kus translatsioon termineeritakse järgneks rohkem kui 50-55 nt allavoolu intron.


Kuid intron splaissitakse välja tuumas enne seda kui ribosoom saab tsütoplasmas stop koodonil termineerida!


Tuumas toimuv splaissing jätab 20-24 nt splaisingu toimumiskohast ülesvoolu maha valgulise kompleksi- EJC (exon-junction complex)


Ejc komponendid
EJC komponendid toimumiskohast ülesvoolu maha valgulise kompleksi- EJC (exon-junction complex)


Ecj transporditakse ts toplasmasse seal eemaldatakse ta mrnalt esimese translatsioonits kli k igus
ECJ transporditakse tsütoplasmasse, seal eemaldatakse ta mRNAlt esimese translatsioonitsükli käigus.


Esimene translatsioonitsükkel (võimalik, et vaid ühe ribosoomi poolt läbi viidud ühe valgumolekuli süntees) toimub arvatavasti veel siis kui mRNA on veel tuumamembraaniga seotud ja on kindlasti seotud CBP80-CBP20 CAPi siduva heterodimeeriga.


Upf valgud on vajalikud nmd ks
Upf valgud on vajalikud NMD-ks ribosoomi poolt läbi viidud ühe valgumolekuli süntees) toimub arvatavasti veel siis kui mRNA on veel tuumamembraaniga seotud ja on kindlasti seotud CBP80-CBP20 CAPi siduva heterodimeeriga.

  • Upf3 seob EJC-le tuumas

  • Upf2 seob Upf3-le transpordil tsütoplasmasse

  • Kui transleeriv ribosoom EJC-d ära ei korista, toob eRF3 endaga seotud Upf1 kohale

  • mRNA lagundatakse

  • Tavaliselt rakus Upf1 hüpofosforüülitud

  • Upf1 fosforüülimine (SMG1) ja defosforüülimine (SMG6) NMD-ks vajalik


Ejc ja translatsioon
EJC ja translatsioon ribosoomi poolt läbi viidud ühe valgumolekuli süntees) toimub arvatavasti veel siis kui mRNA on veel tuumamembraaniga seotud ja on kindlasti seotud CBP80-CBP20 CAPi siduva heterodimeeriga.

  • Splaissitud mRNA pealt sünteesitakse rohkem valku kui identse järjestusega splaissimata (cDNAlt transkribeeritud) mRNA pealt.

  • EJC valgud (RNPS1, Y14, Magoh) suurendavad translatsiooni saagist kui nad kunstlikult mRNAle siduda.

  • Splaissitud mRNA on palju enam polüsoomidega seotud kui identne splaissimata mRNA.


P rm ja nmd
Pärm ja NMD ribosoomi poolt läbi viidud ühe valgumolekuli süntees) toimub arvatavasti veel siis kui mRNA on veel tuumamembraaniga seotud ja on kindlasti seotud CBP80-CBP20 CAPi siduva heterodimeeriga.

Pärmis introneid vähe, seal pole ka EJC kompleksi põhikomponente (Y14, magoh, eIF4AIII). Aga NMD toimub

Pärmis DSE- downstream sequence element, mis täidab EJC funktsiooni kui asub stop koodonist 3´-suunas



Nmd ts toplasma vs nukleus
NMD tsütoplasma vs nukleus pole ükski neist NMD-ks vajalik.

  • enamus imataja NMD toimub tuumas

  • tuuma NMD mRMA lagundatakse nukleoplasmas

  • esimest translatsiooni tsükkel kas tuumas või tuumaga osaliselt seotud mRNAga?


Nmd ja geeniregulatsioon
NMD ja geeniregulatsioon pole ükski neist NMD-ks vajalik.


Mrna lagundamine bakteris
mRNA lagundamine bakteris pole ükski neist NMD-ks vajalik.

  • Keskmise mRNA (5 kb) transktiptsioon 2 min

  • Translatsioon samuti 2 min (180 kDa valk)

  • Transkriptsiooni indutseerimisest mRNA tekkeni u 2,5 min

  • Transkriptsiooni indutseerimisest valgu tekkeni u 3 min


  • Lagundamine algab 1min peale sünteesi algust 5´-otsast. Seega enne kui 3´-otsa valmist

  • E. colis üle 20 RNaasi, millest 6 osalevad mRNA degradatsioonil

  • Degradatsioon 5´-3´ suunaline, u 2X aeglasem kui translatsioon

  • Bakteris ei ole 5´-3´ eksonukleaasset aktiivsust.

  • endonukleaasid (initseerivad degradatsiooni lõigates viimasest ribosoomist 5´-suunas: seega lagundamise üldine suund ikkagi 5´-3´).

  • 3´-5´ eksonukleaasid lagundavad endo poolt genereeritud jupid


E coli mrna lagundamisel osalevad rnaasid
E. coli mRNA lagundamisel osalevad RNaasid Seega enne kui 3´-otsa valmist


  • Keskmine mRNA poolestusaeg 2 min (30´´-20´) Seega enne kui 3´-otsa valmist

  • Endonukleaasile tundlikud kohad destabiliseerivad mRNAd

  • mRNA struktuurid, mis pidurdavad eksonukleaaside toimet stabiliseerivad (n.RNA I, polütsistroone puf operon)


Puf operoni ekspressiooni regulatsioon
puf Seega enne kui 3´-otsa valmist operoni ekspressiooni regulatsioon


Rna i
RNA I Seega enne kui 3´-otsa valmist


Degradosoom 1 5 2 4x10 3 kda
Degradosoom:1.5-2.4x10 Seega enne kui 3´-otsa valmist 3 kDa

Põhikomponendid:

  • RNase E – 5´-otsast sõltuv ssRNA-spetsiifiline endonukleaas (ds ots või trifosfaat inhibeerib)

  • PNPase – 3´-5´ eksonukleaas

  • RhlB – DEAD box RNA helikaas

    Lisaks substöhhiomeetriliselt:

  • Enolaas, polüfosfaadi kinaas, DnaK, GroEL, polü(A) polümeraas, r-valk S1


E. coli Seega enne kui 3´-otsa valmist degradosoom

Organization of the protein interactions within the RNA degradosome.

A, cartoon of the E. coliRNAdegradosome illustrating the central role of theCTH

of RNase E in the protein interactions (185). The actual stoichiometry and structure of

the components within the degradosome are not certain.

B, summary diagram illustrating the known activities and binding regions in

RNase E. Abbreviations: ENDO, endonucleolytic activity; PAUN, 30 polyadenylate or

polyuridylate nuclease; AR-RBD, arginine-richRNAbinding domain.


Minimaalne degradosoom
Minimaalne degradosoom Seega enne kui 3´-otsa valmist

  • RNase E dimeer

  • PNPase trimeer

  • RhlB dimeer


Degradosoomi funktsioonid
Degradosoomi funktsioonid: Seega enne kui 3´-otsa valmist

  • mRNA lagundamine

  • 5S rRNA protsessimine

  • rRNA lagundamine


Pap polya polymerase
PAP- polyA polymerase Seega enne kui 3´-otsa valmist

  • polyA sabad bakteris lühikesed (10-40 nt) ja haruldased (0.01-paar protsenti igast mRNAst)

  • polyA sabad stimuleerivad RNA degradatsiooni soodustades 3´-5´ ekso aktiivsust

  • polyA lisamine ei pruugi olla degradatsiooni initseeriv etapp

  • Polüadenüleeritakse ka ednonukleaasi produkte – seega degradatsiooni vaheprodukte


Rpst degradatsioon
rpsT Seega enne kui 3´-otsa valmist degradatsioon


Rna i degradatsioon rnasee pap pnpase
RNA I degradatsioon. (RNaseE/PAP/PNPase) Seega enne kui 3´-otsa valmist

  • RNaseE intsieerib degradatsiooni

  • PAP, PNPase  kiire degradatsioon

  • RNA I eluiga 1 min

  • (kui ei adenüleeerita siis half-life u 60 min)


kirjandus mis on abiks: Seega enne kui 3´-otsa valmist mRNA degradation in bacteriaReinhard Rauhut *, Gabriele KlugFEMS Microbiology Reviews 23 (1999) 353^370mRNA turnoverPhilip Mitchell* and David Tollervey†Current Opinion in Cell Biology 2001, 13:320–325NONSENSE-MEDIATED mRNADECAY: SPLICING, TRANSLATIONAND mRNP DYNAMICSLynne E.MaquatNATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 5 | FEBRUARY 2004 |The Escherichia coli RNA degradosome: structure, function and relationship toother ribonucleolytic multienyzme complexesA. J. Carpousis1Biochemical Society Transactions (2002) Volume 30, part 2Nonsense-mediated mRNA decay in mammals Lynne E. Maquat Journal of Cell Science 118, 1773-1776 (2005) THE CAP-TO-TAIL GUIDE TO MRNA TURNOVER Carol J. Wilusz1, Michael Wormington1, 2 & Stuart W. Peltz1,Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 237-246 (2001)


ad