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LIPÓLISIS. Licenciada Mónica Campanaro INTI Lácteos Rafaela Agosto 2004. Hidrólisis enzimática de la materia grasa que produce acumulación de ácidos grasos libres ( FFA ) y provoca la aparición de rancidez en la leche y en los productos lácteos. Sustrato. Glóbulo de Grasa. Lipasas.

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lip lisis
LIPÓLISIS

Licenciada Mónica Campanaro

INTI Lácteos Rafaela

Agosto 2004

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

slide2
Hidrólisis enzimática de la materia grasa

que produce acumulación de ácidos grasos libres ( FFA ) y provoca la aparición de rancidez en la leche y en los productos lácteos.

Sustrato

Glóbulo de Grasa

Lipasas

Enzima

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

slide3

¿QUÉ SON LAS LIPASAS?

L

I

P

O

L

I

T

I

C

O

F

L

A

V

O

R

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

clasificaci n
CLASIFICACIÓN
  • Naturales: propias de la leche
  • Leucocitarias: secretadas por las células somáticas
  • Microbianas: secretadas por la flora psicrótrofa

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

lipasas naturales
LIPASAS NATURALES:
  • Secretadas por las glándulas mamarias
  • Son termolábiles
  • pH óptimo entre 8 y 9
  • Se inhiben en condiciones a altas concentraciones de: sales, AGL y proteínas
  • Atacan preferentemente las posiciones extremas del glicerol → AGLs producidos son ricos en AGs de cadena corta

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

lipasas microbianas
LIPASAS MICROBIANAS
  • Provienen esencialmente de bacterias psicrótrofas (principalmente P. Fluorescens)
  • Su producción se ve favorecida por la presencia de caseínas y proteínas del lactosuero
  • pH óptimo entre 8 y 9, 50% de activiadad al pH de la leche
  • Temperaturas óptimas de acción entre 30 y 40ºC
  • Atacan preferentemente los triglicéridos homogéneos, con AG de cadena corta o insaturadas

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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SUSTRATO

Glóbulo de Grasa

Triglicéridos protegidos por una

“membrana”

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TIPOS DE LIPÓLISIS

1) LIPÓLISIS INDUCIDA

Cuando la leche cruda se somete a tratamientos físicos o químicos que rompen la membrana del glóbulo de grasa y facilitan el acceso de la lipasa a los triglicéridos.

Este tipo de tratamientos se denominan de “Tratamientos de activación” y se producen durante y después del ordeñe.

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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a) Tratamientos de Activación:

  • Agitación y formación de espuma
  • Cambios de temperatura
  • Homogenización
  • Procesos de congelación y derretimiento

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

b c mo afecta la temperatura a estos tratamientos
b) ¿Cómo afecta la temperatura a estos tratamientos?
  • Durante la activación: a menor temperatura más resistencia a la activación  mantener la leche refrigerada
  • Durante el almacenamiento: una vez activada mantener la leche a bajas temperaturas.

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

c problemas en el tambo
c) Problemas en el tambo
  • Ordeñadoras:diseños inadecuados y poco mantenimiento

Entrada de aire en pezoneras

Juntas que pierden

Agujeros y rajaduras en tubos de goma

Bajos caudales de leche

Favorecen entrada de aire → lipólisis

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

c problemas en el tambo1
Cañerías : mayor activación a mayor longitud y número de juntas

Tanque de enfriamiento : formación de espuma, caída de la leche al tanque ⇒ baja activación

Bombeo: Utilización de bombas centrífugas debajo de su capacidad y admisión de aire a través de juntas defectuosa ⇒alta activación

c) Problemas en el tambo

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

c problemas en el tambo2
Almacenamiento

la cantidad de lipólisis aumenta con el tiempo y la temperatura de almacenamiento

La velocidad a la cual ocurre la lipólisis va disminuyendo pero no se frena completamente hasta la inactivación de la lipasa ( pasteurización ).

A mayor tiempo de almacenamiento mayor es la posibilidad del crecimiento bacteriano que también contribuye significativamente a la lipólisis

c) Problemas en el tambo

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

no es determinante y est asociada al pasaje de la leche por las bomba debe ser refrigerado
- no es determinante y está asociada al pasaje de la leche por las bomba - debe ser refrigerado

d) Problemas en el transporte

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

e problemas en f brica
e) Problemas en fábrica
  • Excesivo bombeo → alta agitación y mezcla con aire
  • Desnatado → activación por cambios de T ↳ daño mecánico
  • Mezcla de leche cruda con leche homogenizada
  • Refrigeración deficiente
  • Largos tiempos de almacenaje

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

tipos de lip lisis
TIPOS DE LIPÓLISIS

2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA

  • cuando la leche presenta lipólisis en forma natural sin ningún tipo de activación
  • Se las denomina “leches naturalmente activas”, “leches susceptibles” o “leches espontáneas”
  • Leches “normales” son las que no presentan lipólisis espontánea
  • Porcentaje de vacas en un tambo que producen leche espontánea se estima entre 3 y 35%

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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a) Características de leche espontánea:

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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Alimentación y estado nutritivo

Estado de lactancia

Estación del año

b) Factores relacionados a la vaca

Raza

Mástitis

Producción de leche y de grasa

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TIPOS DE LIPÓLISIS

  • 3) LIPÓLISIS MICROBIANA
  • Producida principalmente por bacterias psicrótrofas, cuya característica es crecer a bajas temperaturas ( ej. Pseudomonas )
  • Las lipasas microbianas pueden atacar al glóbulo de grasa intacto
  • Muchas de ellas son termorresitentes, no se inactivan por procesos de pasteurización y pasan a los productos lácteos donde producen rancidez

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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LIPÓLISIS

EN

PRODUTOS LÁCTEOS

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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¿ Por qué nos interesa estudiar la lipólisis ?

  • La lipólisis produce ácidos grasos libres , que junto a otros compuestos, son los responsables del aroma y sabor de la leche y productos lácteos
  • Según la naturaleza y la cantidad de estos AGLs se producen defectos del flavor.

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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Contribución de los sitemas enzimáticos a la lipólisis de los productos lácteos

AGL en productos lácteos

Lipólisis pre-manufactura:

AGL provinientes de la leche Inducida – Espontánea

  • Lipólisis post-manufactura:
  • AGL desarrollados en los productos.
  • Crecimiento microbiano.
  • Pobre Higiene.
  • Actividad de enzimas termorresitentes

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Defectos del flavor:

C4 – C12

responsables del flavor lipolítico

C10 yC12

Sabor jabonoso

C4 al C8

Sabor rancio

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Ácidos Grasos Libres:

  • Ácidos débiles que se distribuyen en la leche y en los productos lácteos según su solubilidad y la cantidad de agua del producto.
  • En los procesos tecnológicos:
    • los AGL de cadena corta siguen la fase acuosa
    • Los de cadena larga se van con la grasa

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Leche comercial

- la lipólisis no parece ser un tema importante

- Aparece sabor rancio en valores de BDI > 1.5

- A bajos niveles la rancidez hidrolítica en estos productos se aprecia organolépticamente como sabor a viejo, sucio o sabor a vaca.

- A altos valores los defectos se perciben como sabor a cabra, amargo, butírico y rancio

- Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez.

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Crema y Manteca - la crema presenta valores de BDI mayores a los de la leche. - si la leche utilizada en la producción es rancia, los AGL responsables de la rancidez se van parcialmente con el agua. - generalmente la lipólisis desarrollada es post-manufactura - La sal inhibe la acción de las lipasas - Los defectos se perciben como sabor a sucio, amargo, rancioy aceitoso - Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez.

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Quesos

- Los AGL contribuyen en gran parte al flavor característico de muchos tipos de quesos.

- El grado de “aceptación” de esa lipólisis depende del tipo de quesos

-Generalmente presentan lipólisis de post-manufactura debido al agregado de enzimas lipolíticas o a la adición y crecimiento de microorganismos productores de enzimas lipolíticas

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Sin agregado de agentes generadores de lipasas: características organolépticas poco pronunciadas, por ej. quesos blandos y semiduros

C

L

A

S

I

F

I

C

A

C

I

Ó

N

Con agregado de lipasas fúngicas: aroma y sabor pronunciados, por ej. Roquefort, Stilton, Camembert

Con agregado de lipasas gástricas o naturales: características organolépticas bien marcadas, por ej. Quesos duros italianos como Parmesano, Romano, Provolone

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Cuándo consideramos rancidez en un queso?

- Dependerá del tipo de queso y se apreciará organolépticamente, estableciéndose una relacíón entre BDI y umbrales de percepción de rancidez.

- Excesivos valores de AGLs dan sabores rancio, sucio o butírico.

- La rancidez será responsabilidad de las lipasas bacterianas ya que las naturales de la leche se inactivan en las condiciones de pH y contenido de sal del queso.

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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CONSECUENCIAS TECNOLÓGICAS

  • Dificultad en el batido de la crema
  • Pérdida de grasa en el suero de manteca
  • Inhibir las bacterias de starters por FFA (leches fermentadas o cultivadas)
  • Retardar y debilitar acciones del cuajo
  • Disminuye el rendimiento quesero
  • Baja la capacidad del espumado de la leche

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MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AGLs

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

generalidades
Generalidades:
  • No existe un método de Referencia
  • Los métodos se pueden clasificar en:
    • Determinan la “acidez global”⇒ Métodos de rutina
    • Determinan individualmente cada AGL ⇒

métodos cromatográficos.

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Generalidades:

  • Expresión de los resultados:

mmol/100g de grasa ó mmol/l

  • Depende del método utilizado
  • Métodos de aislación de los AGLs:

Desestabilizan la emulsión y separan la grasa: BDI

Extracción con solventes orgánicos:métodos cromatográficos, Deeth

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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Aspectos a tener en cuenta en el análisis de AGLs:

  • 1)Prevención e inhibición de la lipólisis:
    • Inhibición química→ no es la más adecuada, existen ejemplos de uso de Dicromato y H2O2.
    • Inactivación térmica→ se inactiva térmicamente la lipasa. Ejemplos: termisar las muestras hasta 72ºC en un baño y dejarlas 15s una vez alcanzada la T.
    • Inhibición físico-química→ se mezcla la muestra con la mezcla extractiva. Por ej.:en métodos con extracción con solventes, la grasa y los AGLs se extraen con una mezcla nopolar ácida ( la lipasa se inactiva a bajos pH ).

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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2) Aislación de los AGLs:

Método del batido

Aislación de la grasa como tal

Método BDI

Método de Frankel y Tarassuk

Extracción usando solventes orgánicos

Método de Dole

Método de Deeth

Uso de ácido Salicílico

INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

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3) Determinación de los AGLs:

Determinación de la acidez global

Determinación de los AGL individuales

Titulación

Métodos Cromatográficos: GLC, HPLC

Cambio de color en un indicador

Análisis directo de los AGL

Formación de complejos coloreados

Análisis de los éstres metílicos

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m todo de deeth
Método de Deeth
  • Se aplica a leche fluída y leche en polvo
  • Procedimiento:
  • 3 ml de leche + 10 ml mezcla ( Isopropílico:Epetrólero:H2SO4 4N) + 6 ml EP + 4 ml de H20
  • Se agita 15 seg y se deja en reposo 4 minutos
  • se toman 5 ml de la capa superior
  • Se agrega fenolftaleína
  • Se titula con KOH metanólico 0.02 N

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Cálculos:

ųequivalentes/ml de leche = V tit * N * 1000

P*Val

donde Vtit = Volumen del titulante

N = Normalidad del titulante

P= Volumen alícuota/ Volumen capa supeior

Val = Volumen de leche utilizada

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Método del BDI

  • Acidez Titulable de la Grasa: es la cantidad de álcali requerida para neutralizar los ácidos grasos libres contenidos en una masa de grasa presente en la muestra.

Se expresa en:

mmoles de álcali/100 gr. de grasa.

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Método del BDI

  • Principio: Una cantidad de muestra (leche, crema, dulce de leche, queso) es mezclada cuidadosamente con una solución conteniendo Tetrafosfato de sodio y un agente tensioactivo, y calentando en un baño de agua hirviendo para separar la grasa.
  • Una cantidad medida de grasa es disuelta en un solvente orgánico y titulada con álcali alcohólico.
  • Precisión del método: 0.2-2 mmoles /100 gr. de grasa.
  • Repetibilidad: 0.05 mmoles/100 gr. de grasa.

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- En un butirómetro para crema o queso cerrar uno de los extremos y llenar con 16  0.5 ml de leche + 4.5  0.1 ml de reactivo de BDI.- Cerrar y homogeneizar en ángulos de 180 º por 10 veces.- Ajustar la escala con el tapón inferior.- Colocar en Baño María a 95 ºC durante 15 minutos hasta separación de la grasa. - El agua debe estar por arriba del nivel de la muestra.- Pasar a un Baño de 45 ºC hasta que la grasa alcance 45 ºC.

Método del BDI

Separación de la grasa

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Método del BDI

Titulación

- 0.25 gr. de grasa + 5 ml de Fat solventTitular con sn. valorada de TBHA 0.01 M hasta viraje de amarillo a verdoso en ausencia de CO2.

BDI = 100 x V x C = mmoles/100 gr. de grasa

masa muestra

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Método Cromatográfico de Deeth

  • Se aplica a leche y productos lácteos
  • Se determinan los AGL sin previa esterificación
  • Se extraen los AGL con mezcla ácida de Eter étílico y Hexano
  • Se agrega estándar interno ( C5 )
  • La separación de los AGL se realiza pasando el extracto etéreo en columna de alúmina desactivada, los AGL quedan adsorbidos a la alúmina.
  • Los AGL se desorben de la columna mediante el agregado de una mezcla de éter isopropílico con 6% de ácido fórmico.
  • Se inyecta al GLC.

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m todos para determinaci n de agls
Métodosparadeterminaciónde AGLs

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