การวิเคราะห์ทดสอบ Biochemical Oxygen Demand (BOD)

1. การวิเคราะห์ทดสอบ Biochemical Oxygen Demand (BOD)

2. หัวข้อศึกษา หลักการ การเก็บตัวอย่าง วิธีทดสอบหาปริมาณออกซิเจนละลาย วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี การคำนวณ การควบคุมคุณภาพ ออก

3. หลักการ บีโอดี ( Biochemical Oxygen Demand ) หมายถึง ปริมาณของออกซิเจนที่แบคทีเรียใช้ในการย่อยสลายสารอินทรีย์ชนิดที่ย่อยสลายได้ในน้ำภายใต้สภาวะที่มีอากาศ การทดสอบหาค่าบีโอดีโดยทั่วไปเป็นการวัดปริมาณออกซิเจนที่ถูกใช้ในเวลา 5 วัน ในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 องศาเซลเซียส และเนื่องจากออกซิเจนในอากาศสามารถละลายได้ในจำนวนจำกัด คือ ประมาณ 9 มิลลิกรัมต่อลิตร ในน้ำบริสุทธิ์ที่อุณหภูมิที่ 20 องศาเซลเซียส ดังนั้นในการทดสอบค่า บีโอดีในน้ำเสียซึ่งมีความสกปรกมากจึงจำเป็นต้องทำให้ปริมาณความสกปรกเจือจางอยู่ในระดับสมมูลพอดีกับปริมาณออกซิเจนที่มีอยู่ และเนื่องจาการทดสอบค่าบีโอดีนี้ เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์ในน้ำจึงจำเป็นต้องทำให้มีสภาพที่เหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ กล่าวคือ ไม่มีสารพิษ แต่มีอาหารเสริมเพียงพอสำหรับจุลินทรีย์ เช่น ไนโตรเจน ฟอสฟอรัส เป็นต้น นอกจากนี้การย่อยสลายสารอินทรีย์ให้เป็นคาร์บอนไดออกไซด์และน้ำจะกระทำโดยจุลินทรีย์หลายชนิด จึงจำเป็นต้องมีปริมาณจุลินทรีย์ต่างๆเหล่านี้อย่างเพียงพออยู่ในน้ำตัวอย่างที่จะทำการทดสอบ ถ้าไม่มีหรือมีปริมาณน้อยเกินไปควรเติมจุลินทรีย์ ซึ่งเรียกว่า หัวเชื้อ (Seed) ลงไปด้วย กลับเมนู

4. การเก็บตัวอย่าง กลับเมนู

5. วิธีทดสอบหาปริมาณออกซิเจนละลายวิธีทดสอบหาปริมาณออกซิเจนละลาย มี 2 วิธี ดังนี้ Azide Modification Method Membrane Electrode Method กลับเมนู

6. Azide Modification Method สภาวะการทดสอบ การเก็บและรักษาสภาพตัวอย่าง เครื่องมือและอุปกรณ์ สารเคมี ขั้นตอนการดำเนินงาน การคำนวณ กลับ

7. Azide Modification Method สภาวะการทดสอบ ควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างที่อุณหภูมิ 20 + 3 องศาเซลเซียส กลับ

8. Azide Modification Method การเก็บและรักษาสภาพตัวอย่าง เก็บตัวอย่างในขวดแก้วที่มีฝาปิด ขนาด 200-300 มิลลิลิตร ให้ทำการทดสอบภายใน 15 นาที กลับ

9. Azide Modification Method เครื่องมือและอุปกรณ์ • ขวดบีโอดี (BODBottle) ขนาด 300 มิลลิลิตร และมีจุกแบบ Ground– Glass พร้อมฝาครอบพลาสติก (BODCap) • ขวดวัดปริมาตร (Volumetric Flask) ขนาด 200 มิลลิลิตร • ขวดรูปชมพู่ (Erlenmeyer Flask) ขนาด 500 มิลลิลิตร • บิวเรต(Buret) ขนาด 50 มิลลิลตร • ปิเปตแบบปริมาตร (Volumetric Flask) ขนาด 5, 10 และ 25 มิลลิลิตร กลับ

10. Azide Modification Method สารเคมี • สารละลายแมงกานีสซัลเฟต (Manganese Sulfate Solution) • อัลคาไล-ไอโอไดด์-เอไซด์ (Alkali-Iodide-AzideReagent) • กรดซัลฟิวริกเข้มข้น (Sulfuric Acid Conc, H2SO4) • น้ำแป้ง (Starch Solution) • สารละลายมาตรฐานโซเดียมไธโอซัลเฟต (StandardSodiumThiosulfateSolution) ความเข้มข้น 0.025 Mหรือ0.025 N • สารละลายมาตรฐานไบไอโอเดต(Standard Bi-Iodate Solution) ความเข้มข้น 0.0021 Mหรือ 0.025 N กลับ

11. Azide Modification Method ขั้นตอนการดำเนินงาน เติมสารละลายแมงกานีส (II ) ซัลเฟต ปริมาตร 1 มิลลิลิตร และอัลคาไล-ไอโอไดด์-เอไซด์รีเอเจนต์ ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ลงในขวดแก้วที่ใส่ตัวอย่างน้ำ โดยให้ปลายปิเปตอยู่ใต้ผิวของตัวอย่างน้ำปิดจุกระวังอย่าให้มีฟองอากาศและผสมให้เข้ากันโดยคว่ำขวดขึ้นลงอย่างน้อย 15 ครั้ง ตั้งทิ้งไว้ให้ตกตะกอนจนได้ปริมาตรน้ำใส ประมาณครึ่งหนึ่งของขวด ไป 2/5

12. Azide Modification Method ขั้นตอนการดำเนินงาน เมื่อตั้งทิ้งไว้จนสารละลายใสข้างบน ประมาณครึ่งหนึ่งของขวดแล้ว เติมกรดซัลฟิวริกเข้มข้นปริมาตร 1 มิลลิลิตร ลงไปในขวดแก้วโดยให้กรดค่อยๆไหลลงข้างๆคอขวด ปิดจุกผสมให้เข้ากัน โดยคว่ำขวดขึ้นลงจนตะกอนละลายหมด ไป 3/5

13. Azide Modification Method ขั้นตอนการดำเนินงาน ถ้าใช้ขวดแก้วที่มีฝาปิดที่มีความจุ 300 มิลลิลิตร จะใช้ตัวอย่างน้ำจากขวด เท่ากับ 201 มิลลิลิตร เพื่อนำไปไตเตรท ทั้งนี้เพื่อให้ปริมาณตัวอย่างนี้มีค่าเท่ากับปริมาตรน้ำตัวอย่างเริ่มต้น 200 มิลลิลิตร จะเป็นการง่ายต่อการคำนวณ เหตุที่ใช้น้ำตัวอย่างในขวดแก้วปริมาตร 201 มิลลิลิตร เนื่องจากมีการสูญเสียตัวอย่างน้ำจากขวดแก้วโดยการแทนที่ของสารละลายเคมีที่เติมลงไปทั้งสิ้น 2 มิลลิลิตร สารละลายแมงกานีส (II) ซัลเฟตปริมาตร 1 มิลลิลิตร และอัลคาไล-ไอโอไดด์-เอไซด์รีเอเจนต์ปริมาตร 1 มิลลิลิตร รวมเป็น 2 มิลลิลิตร) ดังนั้นปริมาตรน้ำตัวอย่างในขวดแก้วซึ่งจะต้องใช้ในการไตเตรทเพื่อให้เป็นการใช้ตัวอย่างน้ำจริงจำนวน 200 มิลลิลิตร จึงควรเท่ากับ (200 × 300)/(300-2) = 201 มิลลิลิตร ไป 4/5

14. Azide Modification Method ขั้นตอนการดำเนินงาน ไตเตรทตัวอย่างน้ำที่ปิเปต จากข้อ 4กับสารละลายมาตรฐานโซเดียมไธโอ-ซัลเฟตความเข้มข้น 0.0021 Mจนกระทั่งสารละลายมีสีเหลืองอ่อนจาง เติมน้ำแป้งจำนวน 2-3 หยด จะได้สารละลายสีน้ำเงินเข้มไตเตรทต่อไปจนกระทั่งสีน้ำเงินจางหายไป บันทึกปริมาตรของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไธโอซัลเฟตที่ใช้ กลับ

15. Azide Modification Method การคำนวณ ถ้าใช้สารละลายที่เกิดปฏิกิริยาในขวดแก้วมาเพื่อการไตเตรทปริมาตร 200 มิลลิลิตร และสารละลายโซเดียมไธโอซัลเฟต (0.025 M) ที่ใช้ในการไตเตรท เท่ากับ 1 มิลลิลิตร ปริมาณออกซิเจนละลายในตัวอย่างน้ำจะมีค่าเท่ากับ 1 มิลลิกรัมต่อลิตรของออกซิเจนละลาย แต่ถ้าใช้สารละลายมาตรฐานโซเดียมไธโอซัลเฟตที่มีความเข้มข้นเป็นอย่างอื่นให้คำนวณปริมาณออกซิเจนละลาย ดังสมการ DO = 40 × M × V เมื่อ DO= ปริมาณออกซิเจนละลาย (มิลลิกรัมต่อลิตร) V = ปริมาตรสารละลายมาตรฐานโซเดียมไธโอซัลเฟตที่ใช้ในการไตเตรท(มิลลิลิตร) M =ความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไธโอซัลเฟตที่ใช้ในการไตเตรท (โมลต่อลิตร) กลับ

16. Membrane Electrode Method สภาวะการทดสอบ การเก็บและรักษาสภาพตัวอย่าง เครื่องมือและอุปกรณ์ สารเคมี ขั้นตอนการดำเนินงาน การควบคุมคุณภาพการทดสอบ กลับ

17. Membrane Electrode Method สภาวะการทดสอบ ควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างที่อุณหภูมิ 20 + 3 องศาเซลเซียส กลับ

18. Membrane Electrode Method การเก็บและรักษาสภาพตัวอย่าง เก็บตัวอย่างในขวดแก้วที่มีฝาปิด ขนาด 200-300 มิลลิลิตร ให้ทำการทดสอบภายใน 15 นาที กลับ

19. Membrane Electrode Method เครื่องมือและอุปกรณ์ • ขวดบีโอดี (BODBottle) ขนาด 300 มิลลิลิตร และมีจุกแบบ Ground – Glass • เครื่องวัดค่าออกซิเจนละลาย (DOMeter) กลับ

20. Membrane Electrode Method สารเคมี • สารละลายปรับเทียบศูนย์ ( Zero OxygenSolution) กลับ

21. Membrane Electrode Method ขั้นตอนการดำเนินงาน ปรับเทียบ (Calibration) เครื่องวัดค่าออกซิเจนละลาย (DOMeter) ตรวจวัดอุณหภูมิของน้ำตัวอย่างให้มีค่าใกล้เคียงกับสภาวะอุณหภูมิที่ทำการ Calibration เครื่อง DOMeter เพื่อให้การวัดมีความถูกต้องมากที่สุด เก็บน้ำตัวอย่างใส่ขวดแก้วที่มีฝาปิด ขนาด 250-300 มิลลิลิตรให้เต็มขวด จุ่มอิเล็คโทรด ลงไปบนปากขวดบีโอดีโดยให้อิเล็คโทรด แนบสนิทกับ ปากขวด บันทึกค่าออกซิเจนละลายที่แสดงบนหน้าจอเมื่อตัวเลขแสดงค่าคงที่ค่าที่ได้คือค่าดีโอ (DissolvedOxygen) ในหน่วยมิลลิกรัมต่อลิตร กลับ

22. Membrane Electrode Method การควบคุมคุณภาพการทดสอบ • การทวนสอบด้วยสารละลายปรับเทียบศูนย์ (Zero OxygenSolution) ควรมีค่าออกซิเจนละลายไม่เกิน 0.2 mg/L กลับ

23. วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี สภาวะการทดสอบ เครื่องมือและอุปกรณ์ สารเคมี ขั้นตอนการดำเนินงาน กลับเมนู

24. วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี สภาวะการทดสอบ เตรียมและทดสอบตัวอย่าง ที่ควบคุมอุณหภูมิ 20 + 3 องศาเซลเซียส หรือควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างที่อุณหภูมิ 20 + 3 องศาเซลเซียส อินคิวเบท (Incubate) ตัวอย่างเป็นเวลา 5 วัน + 6 ชั่วโมง ในที่มืด ณ อุณหภูมิ 20 + 1 องศาเซลเซียส กลับ

25. วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี เครื่องมือและอุปกรณ์ • ขวดบีโอดี (BODBottle) ขนาด 300 มิลลิลิตร และมีจุกแบบ Ground – Glassพร้อมฝาครอบพลาสติก (BODCap) • ตู้ควบคุมอุณหภูมิ (Incubator) ที่สามารถป้องกันไม่ให้แสงผ่านเข้าไปได้และสามารถควบคุมอุณหภูมิ 20 + 1 องศาเซลเซียส โดยมีค่าความคาดเคลื่อนไม่เกิน +1 องศาเซลเซียส • ตู้อบ (Oven) • กระบอกตวง (Cylinder) ขนาด 1,000 มิลลิลิตร • ปิเปตแบบปริมาตร (VolumetricPipet) ขนาด 0.1, 1.0, 10, 25, 50, 100 มิลลิลิตร ไป 2/2

26. วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี เครื่องมือและอุปกรณ์ • โหลแก้วสำหรับเตรียมน้ำเจือจาง • เครื่องจ่ายลม และหัวลูกฟู่ (หัวจ่ายลม) • เครื่องชั่งละเอียด (AnalyticalBalance) ที่มีขีดความสามารถในการชั่งน้ำหนักที่ 0.1 มิลลิกรัม • ลูกยาง • กระดาษวัดค่าความเป็นกรดและด่าง (pH Paper) • บีกเกอร์ (Beaker) พลาสติก • แท่งแก้วคนสาร • เครื่องกวนแม่เหล็ก (MagneticStirrer) และแท่งแม่เหล็ก (MagneticBar) • ขวดสำหรับฉีดล้าง (WashingBottle) ชนิดพลาสติก กลับ

27. วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี สารเคมี • น้ำที่ใช้ในการเตรียมน้ำเจือจาง (Dilution Water) • สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (Phosphate Buffer Solution) • สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต (Magnesium Sulfate Solution) • สารละลายแคลเซียมคลอไรด์ (Calcium Chloride Solution) • สารละลายไอร์รอน (III) คลอไรด์ (Iron (III)Chloride Solution) • สารละลายกรดและด่าง (Acid and Alkali Solution) ความเข้มข้น 1 N • สารละลายโซเดียมซัลไฟต์(Sodium Sulfite Solution) ความเข้มข้น 0.025 N • หัวเชื้อจุลชีพ (Seed Suspension) • Quality Control Standard (QCS) สารละลายกลูโคสและกรดกลูตามิก (Glucose-GlutamicAcidSolution) ที่มีค่าบีโอดี 198 มิลลิกรัมต่อลิตร กลับ

28. วิธีทดสอบหาค่าบีโอดี ขั้นตอนการดำเนินงาน การเตรียมตัวอย่าง วิธีการหาโดยตรง (Direct Method) วิธีการเจือจาง (Direct Method) การบ่ม (Incubator) กลับ

29. การเตรียมตัวอย่าง ตรวจวัด pH ของน้ำ ถ้ามีค่าอยู่ในช่วง 6.0-8.0 ให้นำไปทดสอบได้เลย ถ้า pH ไม่อยู่ในช่วง 6.0 -8.0 ให้ปรับ pH ให้อยู่ ระหว่าง 7.0 ถึง 7.2 โดยปริมาตรของกรดหรือด่างที่ใช้ปรับไม่ทำให้ปริมาตรของตัวอย่างน้ำเปลี่ยนแปลงมากกว่าร้อยละ 0.5 ตัวอย่างที่มีสารประกอบคลอรีนตกค้าง ให้ตั้งทิ้งไว้ 1-2 ชั่วโมงในที่ที่มีแสงสว่างคลอรีนตกค้างจะสลายตัวไป ในกรณีที่มีคลอรีนตกค้างจำนวนมากในตัวอย่าง ต้องกำจัดโดยการใช้โซเดียมซัลไฟต์ การหาปริมาณคร่าว ๆ ของโซเดียมซัลไฟต์ที่จะเติมทำได้โดยใช้ตัวอย่างน้ำ 100 – 1,000 มิลลิลิตร เติมกรดอะซิติก (1+1) หรือกรดซัลฟิวริก (1+50) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ตามด้วยสารละลายโปแตสเซียมไอโอไดด์ 10 มิลลิลิตร (10 กรัมในน้ำ 100 มิลลิลิตร) แล้วไตเตรทด้วยโซเดียมซัลไฟต์ 0.025 N (จากข้อ 8.7) ใช้น้ำแป้งเป็นอินดิเคเตอร์ จนถึงจุดยุติ ก็จะทราบปริมาณของโซเดียมซัลไฟต์ที่จะต้องใช้ แล้วจึงเติมลงไปในตัวอย่างน้ำที่จะหาค่าบีโอดี เขย่าตั้งทิ้งไว้ 10 –20 นาที ไป 2/2

30. การเตรียมตัวอย่าง น้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรมบางประเภท เช่น โรงงานชุบโลหะจะมีโลหะที่เป็นสารพิษอยู่ ตัวอย่างประเภทนี้จำเป็นต้องได้รับการศึกษาและบำบัดเป็นกรณีพิเศษ ตัวอย่างที่มีปริมาณออกซิเจนละลายน้ำเกินจุดอิ่มตัว (ค่าออกซิเจนละลายน้ำมากกว่า 9 มิลลิกรัมต่อลิตร ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส) ให้ลดปริมาณออกซิเจนลงมาจนถึงจุดอิ่มตัวโดยการนำตัวอย่างน้ำที่อุณหภูมิ 20 +3 องศาเซลเซียส ไม่ต้องเต็มขวดและเขย่า หรือโดยการเติมอากาศที่สะอาด อุณหภูมิของตัวอย่างต้องอยู่ในช่วง 20 +3 องศาเซลเซียสก่อนทำการทดสอบ กลับ

31. วิธีการหาโดยตรง (Direct Method) วิธีนี้ใช้กับตัวอย่างที่มีค่าบีโอดี ไม่เกิน 7 มิลลิกรัมต่อลิตร ไม่จำเป็นต้องเจือจางตัวอย่างส่วนใหญ่ ได้แก่ น้ำจากแม่น้ำลำคลอง ให้ทดสอบตัวอย่างตามขั้นตอนดังต่อไปนี้ นำตัวอย่างน้ำที่มีการปรับอุณหภูมิให้ได้ 20 + 3 องศาเซลเซียส เติมอากาศให้ตัวอย่างมีปริมาณออกซิเจนที่ละลายในน้ำใกล้จุดอิ่มตัว รินตัวอย่างน้ำลงในขวดบีโอดีจนเต็มอย่างน้อย 3 ขวด (กรณีทดสอบหาปริมาณออกซิเจนละลายโดยวิธี Azide Modification) หรืออย่างน้อย 2 ขวด (กรณีหาปริมาณออกซิเจนละลายโดยวิธี Membrane Electrode) ระวังอย่าให้มีฟองอากาศ ปิดจุกให้สนิทและเติมน้ำเจือจางหล่อที่ปากขวด นำขวดหนึ่งมาหาค่าออกซิเจนละลาย โดยวิธี Azide Modification หรือวิธี Membrane Electrode บันทึกค่าออกซิเจนละลายวันแรก ให้เป็น DO0 ไป 2/2

32. วิธีการหาโดยตรง (Direct Method) นำอีกขวดบีโอดี 2 ขวด ใส่ในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่อุณหภูมิ 20 + 1 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วัน หลังจาก 5 วันแล้ว นำตัวอย่างน้ำนั้นมาหาปริมาณออกซิเจนละลายที่เหลืออยู่ โดยวิธี Azide Modification หรือวิธี Membrane Electrode ให้เป็น DO5 กลับ

33. วิธีการเจือจาง (Direct Method) วิธีนี้ใช้กับตัวอย่างที่มีความสกปรกสูงโดยมีค่าบีโอดีมากกว่า 7.5 มิลลิกรัมต่อลิตร ซึ่งถ้าไม่เจือจางตัวอย่าง แบคทีเรียจะใช้ออกซิเจนหมดก่อนเวลา 5 วัน ทำให้ปริมาณออกซิเจน ที่ละลายน้ำมีค่าเท่ากับศูนย์ จึงไม่สามารถหาค่าบีโอดีได้ การเตรียมน้ำเจือจาง (Dilution Water) น้ำเจือจาง (ตามข้อ 8.1) ที่ปราศจากสารพิษ ปรับอุณหภูมิให้อยู่ในระหว่าง 20 +3 องศาเซลเซียส ปรับคุณภาพน้ำเจือจางโดยเติมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ แมกนี-เซียมซัลเฟต แคลเซียมคลอไรด์ และไอร์รอน (III) คลอไรด์อย่างละ 1 มิลลิลิตรต่อน้ำเจือจาง 1,000 มิลลิลิตร เติมอากาศให้มีออกซิเจนละลายอิ่มตัว อย่างน้อย 1 ชั่วโมง ไป 2/7

34. วิธีการเจือจาง (Direct Method) ขั้นตอนการเจือจางตัวอย่าง เนื่องจากการทดสอบค่าบีโอดี อาศัยปฏิกิริยาทางชีวเคมีโดยมีจุลินทรีย์เป็นตัวกลางในการย่อยสลาย สภาวะแวดล้อมจะมีผลต่อการทดสอบมาก ทำให้ค่าบีโอดีที่ได้มีความผันแปรสูง การทดสอบตัวอย่างหนึ่ง ๆ จึงควรเจือจางอย่างน้อยจำนวน 3 ความเข้มข้นให้ครอบคลุมค่าบีโอดีที่ประเมินไว้ ผู้วิเคราะห์อาจใช้ข้อมูลใน ตารางเจือจางตัวอย่าง เป็นแนวทางในการเลือกอัตราการเจือจาง (%การเจือจาง) ที่เหมาะสม ไป 3/7

35. ตารางเจือจางตัวอย่าง วิธีการเจือจาง (Direct Method) กรณีการเจือจางในขวดบีโอดีขนาด 300 มิลลิลิตร กรณีเจือจางใน Volumetric Glassware อื่นๆ ไป 4/7

36. วิธีการเจือจาง (Direct Method) การเจือจางในขวดบีโอดี เติมน้ำผสมเจือจางลงในขวดบีโอดีขนาด 300 มิลลิลิตร ประมาณ 100 มิลลิลิตร จำนวนอย่างน้อย 2 ขวดต่อชุดการเจือจาง โดยให้น้ำค่อยๆไหลลงตามข้างขวดบีโอดี (ในกรณีที่วัดออกซิเจนละลายด้วยเครื่อง DO Meter อาจเจือจางตัวอย่างลงในขวดบีโอดี จำนวน 1 ขวดต่อชุดการเจือจางก็ได้) เติมหัวเชื้อจุลชีพในกรณีที่จำเป็น เติมตัวอย่างตามที่คำนวณไว้ เติมน้ำผสมเจือจางลงจนเต็มคอขวดพอดี ระวังอย่าให้เกิดฟองอากาศ ปิดฝาจุกให้แน่นอย่าให้มีฟองอากาศ คว่ำขวดไปมาหลายๆครั้งเพื่อให้ตัวอย่างในขวดผสมกันดี แล้วนำขวดที่ 1ไปหาค่าออกซิเจนละลายวันแรก (DO0) ไป 5/7

37. วิธีการเจือจาง (Direct Method) การเจือจางในขวดบีโอดี ขวดที่สอง ให้เติมน้ำเจือจางหรือน้ำกลั่นที่ปากขวดแล้วครอบด้วยฝาพลาสติกอีกครั้งเพื่อป้องกันการระเหยของตัวอย่าง นำไปอินคิวเบท (Incubate) ที่อุณหภูมิ 20  1 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วัน + 6 ชั่วโมง แล้วหาค่าออกซิเจนละลายวันที่ห้า (DO5) ในกรณีที่วัดค่าออกซิเจนละลายด้วยเครื่อง DO Meter และเจือจางตัวอย่างในขวดบีโอดี จำนวน 1 ขวดต่อชุดการเจือจาง หลังจากที่วัดค่าออกซิเจนละลายวันแรก (DO0) แล้ว ให้ปิดฝาจุกให้แน่นอย่าให้มีฟองอากาศ (อาจเติมน้ำเจือจางลงไปได้อีกเล็กน้อยหากตัวอย่างที่เจือจางแล้วไม่เพียงพอที่จะสามารถปิดฝาจุกได้โดยมีฟองอากาศ) เติมน้ำเจือจางหรือน้ำกลั่นที่ปากขวดแล้วครอบด้วยฝาพลาสติกอีกครั้งเพื่อป้องกันการระเหยของตัวอย่าง นำไปอินคิวเบท (Incubate) ที่อุณหภูมิ 20  1 องศา-เซลเซียส เป็นเวลา 5 วัน + 6 ชั่วโมง แล้วหาค่าออกซิเจนละลายวันที่ห้า (DO5) ไป 6/7

38. วิธีการเจือจาง (Direct Method) การเจือจางใน Volumetric Glassware ในที่นี้ จะกล่าวถึงการเจือจางในกระบอกตวงขนาด 1,000 มิลลิลิตร โดยดำเนินการ ดังนี้ เติมน้ำผสมเจือจางลงในกระบอกตวงขนาด 1,000 มิลลิลิตรประมาณ 500 มิลลิลิตรโดยให้น้ำค่อยๆไหลลงตามข้างกระบอกตวง เติมหัวเชื้อจุลชีพลงในกระบอกตวงในกรณีที่จำเป็น เติมตัวอย่างตามที่คำนวณไว้ เติมน้ำผสมเจือจางลงจนครบ 1,000 มิลลิลิตร กวนให้เข้ากันโดยใช้แท่งแก้วเสียบจุกยางไว้ที่ปลายชักขึ้นลงเบาๆ อย่าให้เกิดฟองอากาศ ดูดตัวอย่างที่ผสมเข้ากันดีแล้ว ลงในขวดบีโอดีที่แห้งและสะอาด จำนวน 1 ขวด เพียงเล็กน้อยก่อนเพื่อใช้ทำความสะอาดขวดและจุกขวด แล้วเททิ้ง ไป 7/7

39. วิธีการเจือจาง (Direct Method) การเจือจางใน Volumetric Glassware ค่อยๆรินตัวอย่างใส่ขวดบีโอดีอย่างน้อย 3 ขวดต่อ 1 ชุดการเจือจางจนล้นระวังอย่าให้เกิดฟองอากาศ และปิดฝาจุกให้แน่นแล้วครอบด้วยฝาพลาสติกอีกครั้งเพื่อป้องกันการระเหยของตัวอย่าง (ในกรณีที่วัดออกซิเจนละลายด้วยเครื่อง DO Meter อาจเจือจางตัวอย่างลงในขวดบีโอดี จำนวน 1 ขวดต่อชุดการเจือจาง ก็ได้) นำขวดที่ 1ไปหาค่าออกซิเจนละลายวันแรก (DO0) อีก 2 ขวดนำไปอินคิวเบท (Incubate) ที่อุณหภูมิ 20  1 องศาเซลเซียส หล่อด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 5 วัน + 6 ชั่วโมง แล้วหาค่าออกซิเจนละลายวันที่ห้า (DO5) ในกรณีที่วัดค่าออกซิเจนละลายด้วยเครื่อง DO Meter และเจือจางตัวอย่างในขวดบีโอดี จำนวน 1 ขวดต่อชุดการเจือจาง ให้ดำเนินการตามรายละเอียดของวิธีการเจือจางในขวดบีโอดี กลับ

40. การบ่ม (Incubator) หลังจากอินคิวเบทที่อุณหภูมิ 20  1 องศาเซลเซียส ในที่มืดครบ 5 วันแล้ว นำมาหาปริมาณออกซิเจนละลาย ตัวอย่างที่ใช้ได้จะต้องมีปริมาณออกซิเจนละลายเหลืออยู่อย่างน้อย 1 มิลลิกรัมต่อลิตร และมีการใช้ออกซิเจนไปอย่างน้อย 2 มิลลิกรัมต่อลิตร แล้วนำมาหาค่าออกซิเจนละลาย (DO5) กลับ

41. การคำนวณ ไป 2/2

42. การคำนวณ เมื่อ DO0 = ค่าออกซิเจนที่ละลายน้ำวันแรก (มิลลิกรัมต่อลิตร) DO5 = ค่าออกซิเจนที่ละลายน้ำวันที่ 5 (มิลลิกรัมต่อลิตร) S = ค่า Oxygen Uptake ของหัวเชื้อจุลชีพ, DO/mL ของหัวเชื้อที่เติมต่อขวด (S = 0 ถ้าตัวอย่างไม่ได้เติมหัวเชื้อจุลชีพ) V = ปริมาตรของหัวเชื้อในแต่ละขวด (มิลลิลิตร) กลับเมนู

43. การควบคุมคุณภาพ การทดสอบ Dilution Water Blank ทดสอบ Dilution Water Blank อย่างน้อยร้อยละ 5 ของจำนวนตัวอย่างในชุด การทดสอบนั้น โดยใช้น้ำรีเอเจนต์แล้วดำเนินการทดสอบเช่นเดียวกับการทดสอบตัวอย่างทุกขั้นตอนผลการทดสอบ Dilution Water Blank ผลต่างของค่าออกซิเจนละลายก่อนและหลังวันที่ 5 ที่ 20 องศาเซลเซียส ไม่ควรเกิน 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร ไป 2/4

44. การควบคุมคุณภาพ การทดสอบซ้ำ (Duplicate) ทดสอบซ้ำทุกชุดการเจือจาง เพื่อทดสอบความเที่ยงของการทดสอบ คำนวณหาค่า ความแตกต่างสัมพัทธ์ (Relative Percent Difference, RPD) ของผลการทดสอบซ้ำ ควรมีค่าความแตกต่างสัมพัทธ์ น้อยกว่าหรือเท่ากับร้อยละ 20 ไป 3/4

45. การควบคุมคุณภาพ การทดสอบ Quality Control Standard (QCS) ทดสอบ QCS อย่างน้อยร้อยละ 5 ของจำนวนตัวอย่างในชุดการทดสอบนั้นโดยใช้ QCS ทำการทดสอบเหมือนกับตัวอย่างทุกขั้นตอน มีค่าอยู่ในช่วง 198 + 30.5 มิลลิกรัมต่อลิตร ไป 4/4

46. การควบคุมคุณภาพ DO0- DO5 ต้องมีค่าอย่างน้อย 2 มิลลิกรัมต่อลิตร และ DO5 ต้องไม่น้อยกว่า 1 มิลลิกรัมต่อลิตร กลับเมนู