6. Beágyazás (embedding) : műgyanták ( egyik sem ideális ) epoxi poliészter metakrilát

1. 6. Beágyazás (embedding): műgyanták (egyik sem ideális) epoxi poliészter metakrilát 6.1 Ideális műgyanta: könnyen kezelhető állandóan kapható egyenletes minőség dehidratáló folyadékban oldódik alacsony viszkozitású (SPURR 60 cps!!) homogén polimerizációjú kis térfogatváltozás polimerizáció alatt jól metszhető stabil az elektronnyalábban ARALDIT, DURCUPAN, EPON 812 és 815, SPURR (ERL 4206) DGEBA, LR WHITE, LR GOLD, UNICRYL, HISTOCRYL, stb.

2. A komponensektől függ a kötési idő, penetráció, viszkozitás. Komponensek: resin, hardener accelerator plasticizer(flexibilizer) „Resin” viszkozitása módosul az egyéb komponensektől! Keménység-lágyság: metszés, anyag támasztása befolyásolható:plasticizer (flexibilizer) mennyisége nő keresztkötésekbe épül, lágyabbgyanta metszhetőség jó, elektrontűrés rosszabb gyanták keverése, arányuk változtatása EPON 812 és 815 hardener fajtája DDSA lágyabb gyanta HHPA keményebb gyanta accelerator több – keményebb, törékenyebb

3. puha blokk: jól metszhető, lágyabb szövetek, izolált sejtek kemény blokk: jobban támaszt erősebben igénybe veszi a kést keményebb minta (metszhetőség függ a polimerizáltság fokától, irányától is) Tárolás: szobahőn – de vannak bomlékony komponensek is! hűtőben – vizet ne vegyenek fel Fixáláshoz és dehidratáláshoz képest átitatás és beágyazás kevés morfológiai változást okoz zsugorodás: 2%-nál kisebb a jó lipid kioldódás kevés (epoxi, poliészter)

4. 6.2 Használatuk: VIGYÁZNIaz irritáló, mérgező, tumor keltő komponensekkel! (polimerizált gyanta inert) vegyifülke (gőzök belégzésének megakadályozása) bőrre vigyázni – felszívódó komponensek! eszközök használata, tisztántartása jobb elkülönítettüvegárut és eszközöket használni tisztítás, oldás: pl. aceton, kloroform polietilén edények – egyszer használatos eszközök hulladékokat gyűjteni, illetve bepolimerizáltatni

5. 6.3 Polimerizáció: infiltráció után ( 1 óra – több nap) új, tiszta műgyantában kapszula – zselatin (száraz!!) Nr. 00, 0, 1, 2… „BEEM” kiöntőformák: polietilén formák szilikongumi lap /orientálás - számozás jelzés polimerizáció előtt, vagy után hő, vagy UV fény hő: gyanta recept szerint (60, 70 oC, de más is lehet!) UV: szobahőn, de akár hidegszobában is (hő!) „pot life” szobahőn is besűrűsödik (shelf life)friss használata ajánlott szobahő – frisset készsíteni 4 oC – pár hét -20 oC – pár hónap jó metszhetőség homogén és teljes polimerizáció jó infiltráció optimális minta – gyanta keménység

6. 6.4 Epoxi gyanták: a legjobbak strukturális vizsgálatokhoz poliaril észterei a glicerolnak – végén epoxi csoport polimerizáció keresztkötésekkel, 3D struktúra kötés – C – C – és – OH csoportok között O + egyenletes polimerizáció kis térfogatváltozás (kisebb, mint 2%) jó metszhetőség elektronsugárzásra ellenálló - viszkózus gyanták (munka nehezebb, infiltráció lassabb)

7. dehidratálás aceton vagy etanol (PO intermedier) polimerizálásuk általában hővel történik 60-70 oC (de 30 oC 100 h!!) homogén – egyenletes keménységű blokk ha nem: középen puha a minta – rossz átitatás átitatási inkubációs időt növelni (pl. 1:1) fokozatosabb infiltráció keverés infiltráció során alacsonyabb viszkozitású gyantát használni gáztalanítás (vákuum termosztát) beágyazás gyorsítása: minta térfogat csökkentése (0,1 mm!!) 95 oC 1-12h polimerizáció, 100 oC 1h

8. 6.5 Poliészter gyanták: pl. Vestopal W ma ritkán használatosak, epoxihoz hasonlítható lehetőségek + polimerizáció: hő, vagy UV (akár O2 jelenlétében!!) polimerizáció 60 oC-on 12-24 h - bomlékonyság (accelerator 2 hónap után csere), viszkózusak, óvatos kezelést igényel (mint az epoxi gyanták is), robbanékony komponens (benzoyl peroxide) aceton jó dehidratáló hozzá (etanol nem!) mindig jobb friss gyantát készíteni

9. 6.6 Metakrilátok: epoxi gyanták előtt elterjedten használt volt LR WHITE, LR GOLD, UNICRYL, LOWYCRYL, HISTOCRYL n-butil és n-metil metakrilát + katalizátor – polimerizáció hő UV (de: hő!) + vízoldékonyak, esetleg részlegesen azok epitop, aktivitás kevéssé sérül – (immun)citokémia - 20% zsugorodás nem elég stabilak elektron sugárzásban polimerizáció nem egyenletes O2-érzékenyek általában lipid, foszfolipid kioldódás viszonylag viszkózusak (részlegesen polimerizált forma) Használat előtt metakrilátból hidrokinon eltávolítandó!

10. 6.7 Vízoldékony közegek: bevitel vizes közegben nem reagál a mintával DURCUPAN (epoxi) vízoldékony!!, GMA (glikol metakrilát), HPMA (hidroxi propil metakrilát), Nanoplast/Melamine Elvileg kémiai fixálás, víztelenítés elkerülhető + műtermék kevés - rosszul metszhetők tisztán (adalékok)

11. 6.8 PEG embedding: polietilén glikol (4000-6000) növényi és állati szövetekre metszetből vizsgálat előtt kioldani (kritikus pontos szárítás griden /Formvar hártyás és polilizin kezelt/) abs. etanolban oldott PEG 4000 (20, 30, 50, 70%) menete: /opcionálisan: GA fixálás és mosás OsO4 utófixálás és mosás uranil acetát festés és mosás/ dehidratálás abs. etanolig 60 oC vízfürdőn rázatva PEG-etanol soron át /20% (30’), 30% (30’), 50% (1h), 70% (12h)/ olvasztott PEG 4000 2h olvasztott PEG 6000 2h előmelegített laposkiöntőbe, megszilárdulás

12. 6.9 HACH embedding medium: természetes megőrzés ultrastruktúra antigén tulajdonságok komponensek: hydroxihexanedial carbohydrazide hydrazine (irritáló!) keverék polimerizálódása 24h szobahőmérsékleten!!! keverés, első lépés hidegen, 1 M NaOH pH: 7.0 beállításhoz beágyazás menete: 1. mintára (lehet fixált) HACH keverék (10 oC, 2-3h, folyamatos keverés) 2. HACH viaszlemezre – a cseppbe a minta 1. után 3. polimerizáltatás 4.    kivágás, ragasztás blokkra, metszés (10-20 mm/s) Polysciences, Polaron, SPI, Merck, Sigma, Reanal

13. 7. Metszés kés – grid – ultramikrotóm metszet minőségét befolyásolja:metszés sebessége hőmérséklet gyanta keménysége kés élének állapota 7.1 Kés:eleinte fém (FM mikrotechnikai örökség) – tompulás 1950 – üveg kés, 1956 – gyémánt kés üveg: frissen tört jó, él idővel tompul – üveg amorf szerkezet szennyeződésekre, rázkódásra, érintésre érzékeny gyémánt: tartós él – kristályos szerkezet, 10-es keménység, drágább (zafír kés kicsit olcsóbb) Nem gyémánt késsel kezdeni a munkát! Előtte rutin szerzés kell! kés minősége: él tartóssága, él hossza, élszög

14. 7.1.1 Üveg kés: üveg csíkok EM munka céljára ( Alkar, Easy-cut Ultra/Glass) Pittsburg process: függőleges - gyorsabb, egyenletesebbhűtés – keményebb, ridegebb üveg (kékes) Float process: vízszintes - lassabb hűtés, hőmérsékleti és szerkezeti eltérés a két oldal között – puhább üvegcsíkok – 25-38 mm szélesség, 6,4-12 mm vastagság free break – scored break jó kés készítés: pontos, nem mély karcolás minimum nyomás, megfelelő helyen lassú törési folyamat

15. kézzel törés késtörő berendezés kés alakja háromszög rombuszból téglalapból négyzetből karcolás: wolfram karbid fej orientáció fontos kés éle: minőség igazából csak a metszéskor mérhető fel függ: kés élszöge (40-50o karcolás, változtatható!!!) üveg szerkezete minőség nem mindenütt egyforma – fókuszált fény kád/csónak: fém/műanyag/ragasztószalag – folyadék szigetelés: paraffin

16. mosás: detergens és desztillált víz, utána acetonos/etanolos törlés (puhafa/balsafa/bodzabél/hungarocell darabokkal, csak éllel párhuzamos mozdítás!!!, mások szerint ez is káros) ultrahangos késtisztító berendezés, sűrített levegős szárítás újra élezni lehet (de élszög növekszik), „rosszabb minőség” tárolás: saját dobozában, pormentesen ár viszonylag magas (függ az élhossztól, élszögtől) tartós (de sérülhet!!) csak ezzel lehet metszeni bizonyos mintákat

17. 8. A minta faragása, metszés: előkészítés és metszetek készítése 8.1 Faragás – trimmelés: blokk (kapszula eltávolítása) alakja és a minta orientáltsága „piramis” faragás metszési profil – méret, alak 8.2 Késél – metszési sík viszonya – árnyék megvilágítás miatt kés és minta közelítése FŐ A TÜRELEM!!!! 8.3 Metszet: ha jó minden: sorokban, egyenesen, egyenletes vastag szín – vastagság megvilágítás – fény reflexiója – interferencia szín

18. szürke 20 nm ezüst 70 nm arany 100 nm bíbor 160-170 nm kék 210-220 nm méret 0,1-0,5 mm (gyémánt kés – nagyobb) trapéz/téglalap/háromszög alak Méretváltozás!!! Metszet összenyomódik és vastagabb lesz. xilolos/izzópálcás kisimítás (egyben vékonyabbá is teszi)

19. 8.4 Minta felvétele: egyedi metszetek, sorozat metszetek 8.4.1 Gridek: metszetek ezen: „kezelhetőség” mintázat: négyzetrács, méhsejt (hexagonális), téglalap, stb. más mintázat – speciális alkalmazás középpont jelzése koordináták eltérő vastagságú rácsok egy lyukú gridek általános normál szupergrid, slim bar anyag: réz, réz-palládium, nikkel: citokémia, emésztéses kezelések arany (tiszta v. bevont), nylon: citokémia méret: mintatartó függvénye (3 mm) Mesh szám: 100-600 vizsgálható és takart régió aránya!!!

20. HártyázottHártya nélküli /rugalmas, ellenálló alaphártya/ /100-300 Mesh/ /300-600 Mesh/ rosszabb felbontás jobb felbontás C réteg vezetés erősítés érzékenyebb metszet nagyobb áttekintés nagyobb takarás 8.4.2 Hártyaminta erősítése/tartása, e- állóság növelése hő elvezetés, töltések elvezetése (C réteg) 5-10 nm, vékony és egyenletes réteg „hártyázás” szenezés: 10 nm C réteg - rugalmasabb, ellenállóbb, vezető lesz régebben: kollodium, celloidin ma: Formvar /polivinil formaldehid/ Pyroxylin /nitrocellulóz/ Pioloform /formaldehid acetát vinil acetát csoportokkal/ 0,5-1 % kloroformos oldat

21. 8.4.3 Metszetek felvétele: felülről „lecsapva” – kivenni élére állítva, hártyás alámerítve – ráúsztatva – hártya nélküli csipesz: különféle típusok nyomásra záródó (gumi rögzítés) nyomásra nyíló 8.4.4 Metszési hibák: összenyomódás - xilol gőz, heat pen - kinyújtás szakadás (kés v. átitatási hiba, „rossz kontrasztozás”) késnyom (knife mark) periodikus vastagságváltozás (chatter) – kb egyenletes vibrációs vastagságváltozás – „lecseng” sűrűségi (lokális) vastagságváltozás gyűrődések „karcok” (scrath mark)

22. 8.4.5 Ultramikrotóm ős: Minot rendszerű mikrotóm Alapelv: 1. metszet kés egymáshoz viszonyított elmozdulása 2. előtolás mozgó kés – álló minta mozgó minta – álló kés metszet leúsztatása metszési ciklus:metszési mozgás /cutting stroke/ visszamozgás /return stroke/ előtolás: mechanikus vagy hőtágulásos alapelv metszési sebesség (mm/sec) sztereomikroszkóp (20-40x) és megvilágítási rendszer

23. 8.4.6 Metszés minősége: mikrotóm állapota kés állapota metszési folyamat körülményei minta tulajdonságai gyanta típusa A metsző személy ügyessége és türelme! Jobb metszés: vibráció minimalizálása ne legyen sugárzó hő ne legyen huzat statikus töltődés ne legyen optimális páratartalom

24. Ultramikrotóm működése/cutting stroke és return stroke/

25. 9. Festés /kontrasztosítás/: kontraszt javítása nehézfém ionok bevitele: kontraszt nő (OsO4 is fest!) uranil acetát preembedding: 1% vizes oldat postembedding: 1-2% metanolos oldat ólom citrát CO2 érzékenység!! műtermék: aggregátumok és precipitátumok – mosás, CO2 10. Egyéb: fixation pepper: friss fixáló – nem jelentkezik embedding pepper: 1% EDTA – megszünteti

26. Festetlen preparátum Festési típusok Festés „erősítése” (signal amplification)

27. 11. Negatív festés: baktériumok vírusok makromolekulák sötét háttér (e- szóró anyag) – világos tárgy (jobb e- áteresztés) GYORS!!! 10-20 perc alatt vizsgálható preparátum. Na v. K foszfo-volframát: 2% vizes oldat (pH: 7.0) + jó e- szóró, - bizonyos vírusokat károsít Uranil acetát: 0.1-2% vizes oldat + részletgazdagabb, jobban penetrál - kicsapódás radioaktív Uranil formiát: kb. hasonló az uranil acetáthoz Ammónium molibdát: 2% vizes oldat (pH: 4-9) + nincs kicsapódás - kevéssé kontrasztos

28. 12. Replikák: platina /arany/ vékony rétegben fény-árnyék hatású kép (egyik oldal vastagabban gőzölt) shadow casting: hártyás griden tárgy, gőzölés, vizsgálat valódi replikák: csak a replika vizsgálata replikával fedett minta vizsgálata 13. Sztereó képpárok készítése: vastagabb minta – nagyobb HV döntés nélküli és döntött kép készítése képpárból sztereó kép: egymás melletti képek vörös-zöld képpár egymáson polarizált fény – polár szemüveg számítógépes megjelenítés /számítógépes elektronmikroszkópos tomográfia/