1 / 21

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA. Sběr materiálu na izolaci DNA. Obecné zásady: v principu je možné použít kteroukoli část rostliny (i dřevo) ideální je čerstvý materiál problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy)

milica
Download Presentation

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

  2. Sběr materiálu na izolaci DNA • Obecné zásady: • v principu je možné použít kteroukoli část rostliny (i dřevo) • ideální je čerstvý materiál • problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy) • brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů • sbírat pokud možno zdravou tkáň (neinfikovanou ostatními organismy) • sběr omezit radši na jeden typ tkáně • výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně (např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP) • zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)

  3. Fixace materiálu před izolací • Vysoušení • silikagel–asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem) • při pokojové teplotě (nebo v sušárně) – taky funguje, vhodné např. pro mechorosty, lišejníky; ale herbářové položky rostlin mohou být problematické • vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku • vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě

  4. Fixace materiálu před izolací • Nakládání do ethanolu • asi není moc výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy) • Zamrazováním čerstvého materiálu • bez problémů, ale není nutné

  5. Vlastní DNA izolace • Volba extrakční metody • jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství • kolik máme peněz a času: komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie) dražší (40-100 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.) ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky) čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou

  6. Vlastní DNA izolace • Kroky izolace DNA: • rozrušení buněčné stěny - homogenizace materiálu • lyze buněčných membrán -pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA) • odstranění kontaminantů: • proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších... • fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny, • které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce • huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání • polysacharidy • RNA • čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě

  7. Vlastní DNA izolace Homogenizace materiálu - mechanicky: • větší kousky tkáně v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné) • nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2) • drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem

  8. Vlastní DNA izolace • Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak: • sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu • střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice) • Nevysušený materiál: • je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami) • pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty

  9. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • NaOH metoda • velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!) • zvýšené pH denaturuje kromě DNA i proteiny (DNazy), a pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně a supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl) • vhodné i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů • nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR; omezená trvanlivost? • vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat ELFO ani spektrofotometricky

  10. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • CTAB extrakce • NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) • CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí RNA • CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě • přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci: ◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat ◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny) (krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)

  11. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • CTAB extrakce • přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu) pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením bílý DNA pelet (zabarvení značí nečistoty) • DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolema rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku • vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA • zabere ~4 h a víc

  12. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • SDS extrakce • izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) • po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy) • vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem • RNasa A rozštěpí RNA • podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA • výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie • izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)

  13. Vlastní DNA izolace 1 2 3 • Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA: • lyzační fáze, odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany, ošetření RNasou A • navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice) • za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu • DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem) • uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou - objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí) • koncentrace získané DNA ale často nižší! • existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA

  14. Vlastní DNA izolace • Skladování DNA: • čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě • TE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů) • krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC • roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození) • nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování (používat alikvoty) • DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě

  15. Kontrola kvality a kvantity DNA • 1) pomocí spektrofotometru • A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin) • přístroj měří ~ 5 µl vzorku • vlastní hodnota A260 by měla být v rozmezí (0.01-)0.1-1.0 (jinak výpočty nepřesné, dá se ovlivnit ředěním vz.) • z ní přístroj vypočítá koncetraci (nutno brát s rezervou) proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8 (absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá) A320: mělo by být blízké 0 jiné hodnoty indikují znečištění, a odhad koncentrace DNA je nadhodnocený (poměrně časté např. u CTAB izolace) c [ng/µl] = 50 x A260 x dilution factor (pro odstranění efektu kontaminantů lze od A260 odečíst A320, a teprve výsledné číslo dosadit do vzorce – může pak vyjít i záporná koncentr.) A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů ... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)

  16. Kontrola kvality a kvantity DNA nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1µl) • 2) fluorimetricky • barvivo selektivní pro DNA (např. ethidium bromid, PicoGreen) • přesné stanovení koncentrace DNA: není ovlivnění kontaminanty, ale nezjistíme jejich přítomnost!

  17. Kontrola kvality a kvantity DNA • 3) elektroforéza (ELFO) • pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru • vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku) • záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace

  18. Kontrola kvality a kvantity DNA • 3) elektroforéza (ELFO) • vlastní vizualizace DNA: • fluorescenční barviva, které se vážou na DNA – potenciální mutageny • UV transluminátor – ethidium bromid (EtBr, asi mutagen), Sybr Green, Gel Red ... • modré světlo – Sybr Green, Sybr Safe • barvivo možné přidat do gelu nebo loading bufferu, ale způsobuje posuny a deformace bandů(kromě Sybr Safe); stačí pro hrubou kontrolu DNA ◄produkty restrikce PCR produktu: Sybr Green přidán do loading bufferu, stejné fragmenty migrují rozdílně (ovlivněno koncentrací DNA) • nebo obarvením gelu v roztoku barviva po dojetí forézy (post-staining) - dražší, ale nejvíc senzitivní a nezpůsobuje deformace a posuny bandů

  19. Kontrola kvality a kvantity DNA • ELFO genomové DNA • fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny) • pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce! • ... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci) čistá, kvalitní DNA: ◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA ◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací) smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA

  20. Kontrola kvality a kvantity DNA Příklad rozdílné efektifity izolačních metod:kořeny Festuca rubra, PCR amplifikace DNA mykorhizních hub (AMF) MoBio Soil Kit kvalitní, čistá DNA, ale malý výtěžek, nutné použít >15 mg kořenů Qiagen Plant Kit dostatek DNA, ale nepoužitelné, zbarvený izolát, inhibuje PCR CTAB izolace dostatek DNA, ale nepoužitelné, silně zbarvený izolát, inhibuje PCR CTAB izolace + purifikace MoBio CleanUp kitem ztráta části DNA, ale PCR funguje (na další 4 druhy Poaceae ze stejné lokality stačí klasická CTAB izolace)

  21. Kontrola kvality a kvantity DNA • Co s herbářovým materiálem? • recentní položky (<15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžnou PCR, ale může se velmi lišit druh od druhu! • u staršího materiálu nutno vyzkoušet, nadějnější jsou klasické protokoly (CTAB, SDS; asi ale nemá cenu NaOH) • pozor na kontaminaci recentním materiálem! • např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým materiálem • u mechů a lišejníků patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi! • při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem • výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu • doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček

More Related