Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4. PCR

2. Historie • Co bylo před PCR? • k dispozici pouze DNA, kterou se podařilo vyizolovat • fragmenty DNA bylo možné namnožit klonováním (zač. 70. let) • sekvenování NK (od konce 70. let) • RFLP

3. RFLP • RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • variabilita generována restrikčními enzymy z bakterií - rozpoznávají krátkou specifickou sekvenci dsDNA • vyizolovaná genomová DNA naštěpena jedním nebo více enzymy • může být použita např. pouze cpDNA nebo mtDNA (nutná speciální izolace, např. ultracentrifugace v CsCl gradientu pro cpDNA) • fragmenty separovány ELFO, vizualizovány přímo obarvením, nebo přeneseny na membránu, a vizualizace hybridizací se značenou DNA sondou (Southern-blot) • sondy: • specifické pro určitý lokus (např. rDNA; další využití – restrikční mapování genomu, určování pořadí genů pomocí genově specifických sond) • multilokusové (např. hypervariabilní repetitivní sekvence: mini- a mikrosatelity)

4. RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Lokusově specifická sonda: variabilita RFLP patternů 11 izolátů Candida albicans (A - celková genomická DNA po naštěpení enzymem EcoRI) B - Southern blot hybridizace se sondou pro oblast 28S, 18S a 5S rDNA

5. RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Multilokusová sonda: variabilita patternů generovaných pomocí 2 mikrosatelitových sond (r. Candida)

6. RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • Výhody: • kodominantní sonda ELFO • solidní variabilita - při použití sond hybridizujících s hypervariabilními lokusy Nevýhody: • nutné získat dostatek kvalitní DNA • relativně komplikovaná metoda

7. PCR • PCR: • Polymerase Chain Reaction • in vitro namnožení určité části DNA • *1983, ale první (zapomenuté) pokusy už v r. 1971; Nobelova cena za chemii (1993)

8. Princip PCR Templát. DNA Princip PCR PCR cycling 1) • vždy musíme mít k dispozici primery: levý-forward a pravý-reverse • elongace produktu 5´→3´! • první nasynt. vlákna jsou o něco delší než cílový produkt, cyklováním ale téměř absolutně převládne cílový produkt • teoreticky by měla stačit 1 molekula, v reálu je potřeba o něco víc (aspoň 10?) 2) Elongace 3) (DNA polymeráza)

9. Princip PCR Princip PCR enzymatická syntéza DNA: prodlužování vlákna vždy ve směru 5´→3´ (nezapomenout na to ani při designu primerů!)

10. Princip PCR Princip PCR • počet kopií narůstá exponenciálně, postupně ale pokles - opotřebování polymerázy, inhibice narůstajícím množstvím nově nasynt. DNA (nastává obvykle po 30-35 cyklech)

11. Princip PCR • PCR cyklus: • denaturace – rozpletení dvouvlákna templátové DNA, obvykle stačí 94-95°C, 30-60 s • (záleží na CG obsahu, lze ovlivnit přidáním aditiv)

12. Princip PCR • PCR cyklus: • annealing (nasedání) primerů • obvykle v rozmezí ca 48-62°C, 30-60 s • specifické pro každý primerový pár, nutné optimalizovat, příp. odhadnout podle sekvence primerů • přibližně o 3-5°C pod metling temperature (Tm) primerů: Tm =  64.9°C + 41°C x (počet G + C – 16.4) / délka primeru [bp]–pro primery>14bp (Tm = 4°C  x  ( počet G + C) + 2°C  x  (počet A + T) – pro primery <14bp, Wallace rule) http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx

13. Princip PCR • PCR cyklus: • elongace – syntéza komplement. vlákna DNA polymerázou • teplota podle typu polymerázy, obvykle 72°C (ale ~10% aktivity v 37°C) • délka podle aktivity polymerázy a délky amplifikovaného úseku Taq: 1000 bp/min • Taq polymerázy před odpadnutím z vlákna DNA dávají na jeho konec jeden A (terminal transferase activity; využití při AT klonování)

14. Princip PCR Složení PCR reakce: • primery: 0.1-1 µM každého primeru • reakční pufr (Tris-HCl): • MgCl2 příp. MgSO4: 1-4 mM (Mg2+ je kofaktor polymeráz) • KCl: 50 mM • deoxynukleotidy (dNTP): 40-200 µM každého typu dNTP • polymeráza: 0.5-2U / 25 µl reakce • templát: 1-1000 ng / 25 µl reakce (pro genomovou DNA) • s PCR chemikáliemi pracovat na ledu, skladovat v -20°C (hlavně polymeráza!) • ideálně alikvoty (dNTP jsou senzitivní na opakované zamražování; výhodné i proti kontaminacím) • PCR produkt naopak snese hodně…

15. Princip PCR • Střídání teplot: • speciální PCR zkumavky pro optimální tepelnou vodivost • nejdříve manuálně (vodní lázně o příslušných teplotách) • termální cyklery

16. Princip PCR Příklad PCR cyklování: • 95°C – 3 min počáteční denaturace DNA 35x: 95°C – 3 min denaturace Ta – 1 min nasedání primerů 72°C – 1 min elongace 72°C – 10 min závěrečná elongace (dosynt. případná neúplná vlákna) 5°C hold temp. drží teplotu dokud nevyzvedneme vzorky z cykleru Vlastní příprava PCR: • objem 1 reakce může být libovolně v rozmezí 5-100 µl • namíchat premix pro požadovaný počet vzorků, vždy používat negativní kontrolu (PCR směs bez DNA → kontrola reakčních komponent, zda nejsou kontaminované DNA) • komerčně dodávané tzv. mastermixy – obsahují všechny složky reakce kromě primerů a templátu • před přesunem do cykleru držet vzorky na ledu

17. Princip PCR ELFO produktu PCR: amplifikace 1 lokusu (za předpokladu, že se alely neliší délkou): neg. kontrola (bez templátu) cílový PCR produkt nespecifický PCR produkt dimery primerů

18. Princip PCR • PCR polymerázy: • nejdříve se musely měnit po každém PCR cyklu (zničení tepelnou denaturací; Klenowův fragment) • různé typy PCR polymeráz se liší: • procesivitou - počet nasynt. bp/min • chybovostí - inkorporace nesprávného nukleotidu • reakčními podmínkami - složení reakčního pufru, optimální elongační teplota, kolik musíme dát enzymu atd. • průlomem izolace termostabilní Taq polymerázy *1965 (bakterie Thermus aquaticus)

19. Princip PCR • nejčastěji používané PCR polymerázy: • Taq(Thermus aquaticus; 1965) 1 kb/min (<5 kb), 72°C, frekvence chyb 1x10-4– 2x10-5, tvoří polyA-konce; nejlevnější • Ex Taq – modifikace Taq, 5x míň chyb (proof-reading = 3´to 5´ exonuclease activity), tvoří polyA-konce • Pfu (Pyrococcus furiosus; 1991) 0.5-1 kb/min, 72°C, frekvence chyb ~2x10-6 (proof-reading); MgSO4 jako zroj Mg2+ • Vent polymerase (Tli, Thermococcus litoralis) 1 kb/min (<6 kb), 72°C, chybovost ~mezi Taq a Pfu (proof-reading); více teplotně stabilní (Taq half-life ~1h/94-95°C, Vent half-life ~7h/94-95), proto celkově lepší pro delší úseky

20. Princip PCR amplifikace dlouhých úseků, genomových fragmentů: • Phusion polymerase (<20 kb) 1 kb/15-30s; 6x míň chyb než Pfu (proof-reading) ◄ fúze dvou proteinů: modrá jednotka váže dsDNA zelená jednotka (~Pyrococcus) syntetizuje • LA polymerase (<30-40 kb; Long and Accurate) 1kb/min; Taq polymeráza + proof-reading jednotka

21. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: • příčina: nespecifická vazba primerů • teplota annealingu – zkusit různé Ta, nebo gradient (např. po 1-2°C) • touch-down PCR: první cykly PCR jsou zásadní pro specifitu → pokud primery nenasedají specificky, tak se případný mismatch zafixuje; v prvních cyklech začít s vyšší Ta, a postupně ji v následujících cyklech snižovat (např.: 1. cyklus – 60°C, 2. cyklus 59°C, ...) • zkrácení času annealingu • snížit koncentraci primerů, polymerázy • koncentrace MgCl2 (např. po 0.5 mM) - spíše snižovat (Mg2+ ale vychytává dNTP, pokud zvyšujeme výrazně, je třeba navýšit dNTP; nebo se naopak dá použít pro redukování dlouhých nespecif. produktů – zvýšení Mg2+ sníží dostupnost dNTP) • koncentrace KCl (ovlivňuje denaturaci DNA, kratší fragmenty preferenčně denaturují za vyšší koncentrace KCl) • krátké nespecif. produkty: ↓ KCl • dlouhé nespecif. produkty: ↑ KCl (> 50 mM může inhibovat Taq)

22. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: • příčina: nespecifická vazba primerů • dlouhé nespecif. produkty může redukovat zkrácení elongace • Cold-start: vzorky před umístěním do cykleru držet na ledu! (omezení aktivity polymerázy) Hot-start polymerázy: blokovány navázanou protilátkou, aktivovány až počáteční denaturací → nevznikají nespecifické PCR produkty způsobené sníženou aktivitou polymerázy před umístěním vzorků do cykleru • ředění DNA templátu (např. 1:10) • snižování počtu PCR cyklů

23. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: • příčina: krátké, zdánlivé nespecif. produkty mohou být • nedosyntetizovaná vlákna cílového úseku • podpořit činnost polymerázy • prodloužením času elongace • zvýšením koncentrace polymerázy • koncentrace MgCl2 • aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein) • prodloužit čas denaturace, nebo přidat aditiva usnadňující denaturaci templátu (10% DMSO, 5% formamid)

24. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: extrakce - vyřezávání cílových bandů z agarózy po ELFO (vhodné např. pro sekvenaci, klonování) • asi nejefektivnější postup pro odstranění dimerů primerů • celý vzorek nanést na 1-1.5% agarozový gel, nechat rozjet v ELFO • ideálně Sybr Green + modré světlo (UV fragmentuje DNA, proto minimalizovat dobu expozice / odstínit např. skleněnou petriskou) • vyřízlý kousek agarózy s cílovým bandem purifikovat běžně dostupnými kity (lyze agarózy, purifikace DNA na membráně) • může být ztrátové → dělat větší PCR reakce (např. 30 a víc µl)

25. Optimalizace PCR 2. Slabá nebo žádná amplifikace • chyba při míchání PCR, nesprávný program apod. – odhalí se pomocí pozitivní kontroly(= vzorek templátu, u kterého máme ověřené, že amplifikuje) • teplota annealingu – pomůže především snižování • zvýšit počet cyklů PCR (max. ca 45) • pokud je málo cílové DNA, pozor na kontaminace! • zvýšit koncentraci templátu • nebo naopak templát ředit (1:10 – 1:1000) – pokud obsahuje inhibitory • spike control: vezmeme pozitivní kontrolu, a smícháme ji se vzorkem který nefunguje → pokud nedá produkt, tak je to inhibitory ve vzorku • zvýšit koncentraci primerů, polymerázy • gradient koncentrace MgCl2 • adititva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein), aditiva usnadňující denaturaci templátu (DMSO, komerční PCR enhancery)

26. Optimalizace PCR 2. Slabá nebo žádná amplifikace • použití více PCR: více cyklů PCR, méně opotřebované polymerázy a) reamplifikace • vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za ± stejných reakčních podmínek • někdy nefunguje (dané typem použitých primerů???) b) nested PCR • vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za použití vnitřních primerů (příp. se použije jeden vnitřní primer + jeden z primerů původní PCR = semi-nested PCR) • obvykle funguje lépe • umožňuje větší specifitu (selektují až 4 primery!) • x musíme mít vnitřní primery...

27. Optimalizace PCR 2. Slabá nebo žádná amplifikace • zkontrolovatprimery: zda sedí na naši cílovou sekvenci - kritický je mismatch na 3´ konci, kde nasedá polymeráza • pokud nesedí, pokusit se o design novýchprimerů: • shromáždit co nejvíc cílových sekvencí, vytipovat vhodná místa - co nejvíce konzervované mezi cílovými sekvencemi • někdy jsou sekvence tak variabilní, je nutné použít tzv. degenerované báze (IUPAC kód - např. M značí A nebo C) http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ - program na design primerů, umožňuje mj. zvolit oblast kam chceme v sekvenci umístit primery, testuje jejich parametry http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx - pokročilejší testování parametrů primerů

28. Optimalizace PCR Obecná pravidla pro design primerů: • 15-28 bp dlouhé, GC obsah 40-60% • pro optimální specifitu by 3´ konec měl být bohatší na GC, ale ne víc jako 3 GC v posledních 5 bázích (zvyšuje riziko nespecif. nasedání) • oba primery by se neměly příliš lišit v teplotě nasedání (max. ~3°C) • neměly by tvořit smyčky, které nedenaturují za annealingové teploty (někdo naopak preferuje slabé smyčky, aby primery nenasedaly nespecif. za nižší teploty) • pozor na dimery primerů: • ◄ stabilní dimer primerů (Delta G<6 kcal/mol), • který je při PCR elongován (5´- 3´!) • pro důslednou eliminaci dimerů nastavit např. v Primer3: • Max Self Complementarity: 3 • Max Self Complementarity: 1 někdy i ideální primery nefungují a naopak teoreticky špatné fungují bez problémů...