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Analyse der Inosin-5 ' -Monophosphat-Dehydrogenase-Aktivität und der IMPDH1-Genexpression in den Lymphozyten von Mycophenolat-Mofetil-behandelteN NierenPatienten . Masterseminar – Marc Müller. 6 . November 2013. Inhalt. 1 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

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Presentation Transcript
masterseminar marc m ller

Analyse der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase-Aktivität und der IMPDH1-Genexpression in den Lymphozyten von Mycophenolat-Mofetil-behandelteN NierenPatienten

Masterseminar – Marc Müller

6. November 2013

inhalt
Inhalt

1 Grundlagen

1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen

2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)

2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente

2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung

3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

1 grundlagen
1 Grundlagen

1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/

1 grundlagen1
1 Grundlagen

1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

Lokalisierung und Besonderheiten:

  • Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links
  • Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung
  • Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte

Einmündung der Nierenarterie

Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter

physiologische Hauptaufgaben:

Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite

(= glomeruläre Filtration)

Regulation des Wasserhaushalts ↔Blutdruck

Regulation der Elektrolytkonzentrationen

Gluconeogenese

Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D)

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1 Grundlagen

1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands

Exemplarische Nephropathien

  • diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes
  • Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren)
  • Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch)
  • Fehlbildungen der Nierengefäße
  • Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom)

Datenquelle:

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1 Grundlagen

1.2 Einblick in die aktuelle nephrologischeStatistik Deutschlands

  • Inzidenz: 210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche Gesamtbevölkerung)
  • Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5):
    • 0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung
    • einer von 1000 Bürgern

GFR = glomeruläre Filtrationsrate

Datenquelle:

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1 Grundlagen

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Nierentransplantation

Dialyse / Blutwäsche

Quelle: Fresenius Medical Care AG

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1 Grundlagen

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Problematik:

  • Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger
  • Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie
  • Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger

Lösung:

Rejektionsprophylaxedurch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie

→ gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers

Nierentransplantation

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1 Grundlagen

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Wichtige immunsuppressive Medikamente

  • Azathioprin
  • Prodrug→ Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert diese zu 6-Mercaptopurin
  • 6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der DNA-/RNA-Synthese
  • Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten
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1 Grundlagen

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Wichtige immunsuppressive Medikamente

  • Calcineurin-Inhibitoren
  • z.B. Ciclosporin
  • Hemmung der Phosphatase Calcineurin
  • dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells)

Quelle: C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin complex.. Nature, 378, 641-644.

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1 Grundlagen

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Wichtige immunsuppressive Medikamente

  • Mycophenolat-Mofetil (MMF)
  • Prodrug
  • 2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA)
  • selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)
  • Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B- und T-Lymphozyten ein

inaktive Prodrug (MMF)

aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA)

1 grundlagen9
1 Grundlagen

1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen

Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie

2 immundiagnostik der inosin 5 monophosphat dehydrogenase impdh
2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat- Dehydrogenase (IMPDH)

2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente

IMPDH-abhängige Oxidation von IMP zu XMP

Angriffspunkt für immunsuppressive MMF-Therapie nach einer Nierentransplantation

Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie

2 immundiagnostik der inosin 5 monophosphat dehydrogenase impdh1
2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat- Dehydrogenase (IMPDH)

2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung

  • Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLCnach Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat
  • RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography

Quelle:chem.uft.uni-bremen.de

2 immundiagnostik der inosin 5 monophosphat dehydrogenase impdh2
2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat- Dehydrogenase (IMPDH)

2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung

Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis):

3 expressionsanalyse des impdh1 gens
3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
  • beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2)
  • mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt

→ alternatives Splicing der mRNA!

Quellen: Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism

National Human Genome Research Institute

3 expressionsanalyse des impdh1 gens1
3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

Ziel: Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik

  • Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität
  • Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-Immundiagnostik
  • Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -regulation

Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

3 expressionsanalyse des impdh1 gens2
3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion