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ADENOVIRUS

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ADENOVIRUS. 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
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adenovirus

ADENOVIRUS

1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane

1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio

1956 studi epidemiologici confermano l’origine virale dell’agente eziologico delle malattie acute dell’apparato respiratorio.

Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili

slide2

ADENOVIRIDAE

più di 100 membri

slide3

Adenovirus umani

SottogruppiTropismo cellulareSierotipi

A tratto GI 12, 18, 31

B polmoni, tratto urinario 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50

C alte e basse vie dell’apparato respiratorio 1, 2, 5, 6

D tratto GI, occhi 8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30,

32, 33, 36,39, 42,49, 51

E tratto respiratorio 4

F-G tratto GI 40, 41

virus generalmente poco patogeni

infezioni lievi ed autolimitanti

slide4

STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS

70-100 nm

Core : ds DNA

- covalentemente legato alla proteina TP

- complessato alla proteina VII

proteina X (proteasi)

proteina V core

proteasi

Capside (252 capsomeri)

240 esoni : trimeri di proteina II

12 pentoni : Base (pentameri di proteina III)

Fibra (trimeri di proteina IV)

70-90 nm

proteina IIIA esoni che circondano i pentoni

proteina IX esoni delle facce

proteina VI ancora l’anello di esoni che circondano ipentoni con il core

proteina VIII ancora gli esoni delle facce al core

slide5

ITR

ITR

SEQUENZE ITR (100bp)

Il GENOMA degli ADENOVIRUS

(ds DNA: 30-36 Kb)

regione ORI (replicazione del genoma)

regioni di controllo trascrizionale

siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I

sequenza di impacchettamento

penetrazione di adenovirus
Penetrazione di Adenovirus
  • entrata mediata da endocitosi clatrina-dipendente
  • Perdita delle fibre

Lisidella membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni

  • A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale :

- perdita dei pentoni III e della proteina IIIa

- dissociazione della proteina VIII

- degradazione proteolitica dellaproteina VI da parte della proteasi presente nel virione (adenina)

-perdita della proteina IX

pH

slide8

50 proteine

geni precoci

geni tardivi

ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS

E- geni precoci

L- geni tardivi

slide9

I GENI PRECOCI

E1A/B

E2A/B

E4

E3

ITR

ITR

slide10

GENE E1A

mRNA 13S proteina 289R

mRNA 12S proteina 243R

trans-attivatori trascrizionali di geni virali e cellulari

  • progressione del ciclo cellulare
  • - legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein)

induzione di apoptosi

- stabilizzazione di p53

slide11

Ruolo di pRb

nella regolazione della proliferazione cellulare

E1A

slide12

E1A

E1A

p14

slide13

GENE E1A

mRNA 13S proteina 289R

mRNA 12S proteina 243R

trans-attivatori trascrizionali

Alterano la progressione del ciclo cellulare:

Stimolano la replicazione del DNA virale

  • Bloccano la risposta ci difesa cellulare:
  • inibizione di STAT1
  • - inibizione di IKK
proteine e1b

Proteine E1B

55 kDa- lega, inibisce e induce la degradazione di p53

19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di Bax

Stabilizzazione, esporto e traduzione preferenziale dei trascritti virali.

Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite.

slide15

E1A

pRB

g

geni proliferativi

a

IKK

E1A

b

IB

E1B

19kd

NF-kB

risposta

innata

E1B

55kd

p53

geni pro-apoptotici

MECCANISMO DI

TRASFORMAZIONE

CAR

integrine

slide16

ESPRESSIONE GENICA

VA

ITR

E1A/B

E2A/B

E4

ITR

E3

L1 L2 L3 L4

L5

E2A - ssDBP)

E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale

replicazione del DNA

trascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali

slide17

ESPRESSIONE GENICA

VA

ITR

E1A/B

E2A/B

E4

ITR

E3

L1 L2 L3 L4

L5

proteine che regolano la risposta della cellula ospite all’infezione

slide18

ESPRESSIONE GENICA

VA

ITR

E1A/B

E2A/B

E4

ITR

E3

L1 L2 L3 L4

L5

proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off della sintesi proteica cellulare

virus associated va rna

Virus-Associated (VA) RNA

1 o 2 trascritti

lunghezza: 200 basi

codificati dalla Polimerasi III

della cellula ospite

VAI

VA

inibizione della dimerizzazione di PKR

- mantenimento della sintesi proteica

- inibizione delle difese anti-virali

replicazione del dna di adenovirus la sequenza ori
REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUSla sequenza Ori

La sequenza Ori:

sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA

localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali

(aumento dell’efficienza di replicazione)

proteinaTPlegata al terminale 5’ di ogni filamento

slide22

- il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi del DNA complementare

REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUSla sequenza Ori

reclutamento della Polimerasi virale e della proteina pre-TP sulla sequenza core

il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza ausiliaria facilita la formazione del complesso

- la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP

replicazione del dna

l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats”

Replicazione del DNA

associazione Pol-pre-TP e ……

sintesi del filamento

complementare

From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

slide24

I geni intermedi o precoci-ritardati

gene IX = proteina IX

stabilizzazione del capside virale

gene IVa2 = proteina IVa2

transattivazione del promotore dei geni L in associazione con L1 52/55 ed E1A

incapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati

esone

trimeri di pIX

slide25

proteine strutturali

proteine scaffold

proteasi

IVa

52 kd

ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI

VA

ITR

E1A/B

E2A/B

E4

ITR

E3

L1 L2 L3 L4

L5

unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L

E1A

MLTF

L1 L2 L3 L4 L5

promotore MLP

slide26

TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L

trasporto facilitato

blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma

accumulo citoplasmatico di mRNA virali

E4orf6

(34KDa)

E1B

55KDa

NES

?

RNA

binding

fattore cellulare

slide27

Ad virus

(shutoff proteins :

L ed E proteins)

TRADUZIONE PREFERENZIALE

nelle fasi tardive dell’infezione

blocco della sintesi proteica della cellula ospite

m7G

eIF4F

slide28

TRADUZIONE PREFERENZIALE

tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di 200 nucleotidi al 5’ (tripartite leader) chepermette ilribosome shunting

L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIa

L2 - polipeptideIII (base dei pentoni)

L3 - polipeptideII (esoni) eproteasi

L4 - polipeptide 100 kDa

L5- polipeptideIV(fibre)

assemblaggio di adenovirus
Assemblaggio di adenovirus
  • proteine singole(no poliproteina)
  • ruolo critico della proteina L1
  • (funzione scaffold ?)
  • citoplasma
  • - formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4.

nucleo

- formazione dei pentameri

di proteina III (pentoni)

- formazione dei trimeri di

proteina IV (fibre)

formazione di capsidi vuoti

rilascio del virus

RILASCIO DEL VIRUS

disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi)

E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)

slide33

TERAPIA GENICA

introduzione del gene esogeno nella cellula “malata”

espressione della proteina

  • - correzione del difetto genetico
  • trasformazione di pro-drug
  • - blocco del processo tumorale
slide34

Il DNA si degrada velocemente

Sistemi di veicolazione del DNA

Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione

Meccanismi non virali

liposomi

polimeri cationici

elettropazione

micro-iniezione

Meccanismi virali

buona protezione del DNA

bassa efficienza,

nessuna specificità

assenza di rischio e di

reazioni immunitarie

ottima protezione del DNA

buona efficienza e specificità

possibile rischio di infezione

reazioni immunitarie

slide35

ADENOVIRUS

infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione

VETTORI PER TERAPIA GENICA

sicurezza

alta infettività e selettività

espressione sostenuta del gene terapeutico

vettori adenovirali

VA

Y

ITR

E1A/B

E2B

E4

ITR

E3

genoma virale

L1 L2 L3 L4

L5

vettore navetta

transgene

Y

ITR

E1A/B

genoma virale

VA

Y

ITR

E2B

E4

ITR

E3

transgene

L1 L2 L3 L4

L5

vettore adenovirale

VETTORI ADENOVIRALI

inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa

(quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb)

ricombinazione

293 cell

lisi

VA

Y

ITR

E2B

E4

E3

ITR

transgene

L1 L2 L3 L4

L5

La produzione dei vettori adenovirali

avviene in cellule della linea cellulare HEK293)

293 cell

E1A

E1B

nucleo

slide38

VETTORI ADENOVIRALI

Trials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF)

  • - bassa efficienza di transfezione
  • (le cellule transfettate - distrutte dall’infezione virale)
  • bassa efficienza di espressione genica
  • - potente risposta immunitaria
  • un esito mortale
  • (danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria scatenata dalle elevate quantità di vettore virale somministrato)

Attualmente non sono utilizzati in trials

di terapia genica nell’uomo

slide40

VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA’

loxP

Y

vettore navetta

transgene

promoter

VA

Y

E2A/B

ITR

E4

ITR

L5

L1 L2 L3 L4

genoma virale plasmidico

ricombinazione in cellule 293

VA

Y

ITR

E4

E2A/B

promoter

transgene

ITR

L5

L1 L2 L3 L4

taglio mediato da Cre

Y

E2B

ITR

transgene

ITR

promoter

slide41

lisi

cellulare

Y

E2B

ITR

ITR

transgene

promoter

La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacità

avviene in presenza di un costrutto “helper”

VA

E2A/B

ITR

E4

ITR

L1 L2 L3 L4

L5

slide42

VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’

Vantaggi: infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione alta capacità (35 kbp)espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80giorni)

Limitazioni:contaminazione da helper (in produzioni su larga scala)bassa resascarsa stabilità

slide43

TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI

AD ALTA CAPACITA’

Distrofia muscolare

(sindrome di Douchen)

Fibrosi cistica

slide44

*

non esprime E1B 55K

ADENOVIRUS ONCOLITICI

ADENOVIRUS Onyx - 015 (dl1520)

*

VA

E4

ITR

E3

ITR

E1A/B

E2A/B

L5

genoma Ad

L1 L2 L3 L4

  • delezione di 827-bp nel gene E1B
  • e parte della regione E3 (gp19K)
slide45

ADENOVIRUS dl1520

replica solo in cellule difettive per p53

p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani

e nel 70% dei tumori della testa e del collo

trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa tumorale)