Le cellule ciliate

1. Le cellule ciliate Dr. Paola Perin Dipartimento di Scienze Fisiologiche-Farmacologiche Cellulari-Molecolari – Università di Pavia

2. Localizzazione delle cellule ciliate • Sistema vestibolare • Sistema della linea laterale • Sistema acustico • Pochi recettori (20000 cellule vestibolari, 16000 cellule acustiche per orecchio) Canali semicircolari Labirinto membranoso Linea laterale Coclea Organi otolitici

3. L’orecchio interno • Aprendo il labirinto osseo si trova all’interno il labirinto membranoso che contiene gli organi sensoriali • Tra il labirinto osseo e membranoso: spazio perilinfatico • Le cellule ciliate sono localizzate in zone specializzate del labirinto

4. Epiteli sensoriali Coclea Ampolle • Creste ampollari nei tre canalisemicircolari (verticale anteriore, verticale posteriore, orizzontale); • Macule negliorgani otolitici (sacculo e utricolo); • Organo di Corti nella coclea Annessi acellulari: • Cupola (canali) • Membrana e massa otolitica (utricolo e sacculo) • Membrana tettoria (coclea) Cupola Otolito Sacculo Canali semicircolari Utricolo Membrana tettoria

5. Struttura degli epiteli sensoriali Polo apicale (endolinfatico) Polo basolaterale (perilinfatico) Epitelio monostratificato Cellule ciliate (meccanocettori) Cellule di supporto (producono annessi acellulari, altre funzioni glia-simile)

6. Fluidi labirintini • Il labirinto e’ bagnato da due fluidi diversi: • Perilinfa (nello spazio perilinfatico, in giallo): alto Na, basso K • Endolinfa (all’interno del labirinto membranoso, in azzurro): alto K, basso Na, bassissimo Ca • L’endolinfa viene continuamente prodotta dall’azione delle cellule della stria vascolare (coclea) o dalle dark cells (vestibolo) e riassorbita dal sacco endolinfatico all’interno del cranio Sacco endolinfatico timpano

7. L’apparato di meccanotrasduzione • Regione apicale: ciuffo di stereociglia • Movimenti delle stereociglia generano la corrente di recettore meccanosensibile (corrente MET) • Regione basolaterale: canali ionici voltaggio-dipendenti, sinapsi • Cellula compatta, senza divisioni nette tra regioni • Feedback elettromeccanico

8. L’apparato apicale chinociglio IHC OHC Sacculo di rana Coclea di topo

9. Struttura dell’apparato apicale • In un ciuffo ciliare, le stereocilia sono disposte a canne d’organo con altezza decrescente a partire dal chinociglio (dove esiste) • Le stereociglia sono collegate tra loro da varie classi di filamenti • I tip links collegano stereociglia di file adiacenti Direzione di collegamento dei tip links

10. Molle di gating • I tip links fungono da molle che trasmettono l’energia meccanica di flessione delle stereocilia ai canali di meccanotrasduzione • Le altre classi di legami tra stereociglia non sono accoppiate con I canali MET • L’apparato meccanosensibile risponde soltanto a movimenti in una direzione • La distruzione o assenza dei tip links elimina la meccanosensitivita’ delle cellule ciliate

11. Biofisica della meccanotrasduzione • I tip link sono continuamente in tensione per contrastare la rigidita’ delle radicole di actina • Due molle in opposizione: Kx(link)=K’x’(actin) • X’ = distanza di separazione delle stereociglia dopo rottura dei tip link • X=hd • H: proiezione sul piano di X’ • D: allungamento della molla di gating • Valori misurati: • X’=130 nm • K’=200 mN/m • X= 7 nm Tip link Radicole di actina

12. Biofisica della meccanotrasduzione • Il gating e’ una modificazione conformazionale di un canale ionico • Cosa succede se un canale meccanosensibile si deforma? • Deformazione stimata: 4 nm Canali aperti Effetto ”tiro alla fune” della complianza di gating Posizione di riposo Canali chiusi

13. Biofisica della meccanotrasduzione • Per aprire un canale ionico bisogna fornire energia • Energia interna stato chiuso: Ec • Energia interna stato aperto: Eo • Probabilita’ di apertura del canale PO: • Per un canale MET l’energia e’ fornita dal movimento del tip link:

14. Biofisica della meccanotrasduzione • Il ciuffo di ciglia viene mosso da una forza esterna • Lo stiramento dei tip links dipende dalla forza applicata e dalla rigidita’ del ciuffo di stereociglia (forza elastica: F=kx) • La rigidita’ diminuisce con l’apertura dei canali MET • Feedback meccanico positivo attorno alla posizione di apertura dei canali MET • Amplificazione del segnale meccanico (altalena)

15. Biofisica della meccanotrasduzione • In assenza di altri meccanismi, l’apparato di meccanotrasduzione a riposo potrebbe oscillare oppure stabilirsi in uno dei due punti di flesso • Il meccanismo di amplificazione meccanica si ha solo attorno al punto di zero • Come fa il sistema a rimanere al punto di zero?

16. Adattamento della meccanotrasduzione • In presenza di stimolazione meccanica prolungata il punto di zero del sistema si sposta • La forza necessaria per mantenere il sistema in una data posizione non e’ costante ma varia con lo stato di apertura dei canali

17. Adattamento della corrente MET Stimolo: flessione costante del ciuffo di ciglia La corrente MET si attiva inizialmente e poi inattiva Dopo lo stimolo, la posizione di riposo iniziale non e’ piu’ il punto di zero L’apparato meccanotrasduttore non cambia la sua sensibilita’, ma il suo punto di zero si sposta! Cambia la distanza tra I due capi del tip link

18. Adattamento della corrente MET In presenza di adattamento, servono stimoli meccanici piu’ forti (spostamenti piu’ lunghi) per evocare la stessa risposta ma la risposta massimale non cambia

19. Meccanismi di adattamento • 2 meccanismi con scale temporali diverse (1-10 ms, 10-100 ms) • Entrambi dovuti al Ca2+ entrato attraverso il canale MET • Adattamento rapido: effetto diretto sul canale (inibizione Ca-dipendente) • Adattamento lento: attivazione di un motore actomiosinico (miosina-1c)

20. Amplificazione e sintonizzazione • L’interazione tra la gating compliance del canale MET e il movimento attivo dovuto all’adattamento produce oscillazioni meccaniche del ciuffo di ciglia • Variando la quantita’ e la natura dei meccanismi di tamponamento ed eliminazione del Ca2+ nelle stereociglia si varia la frequenza delle oscillazioni • Ciascuna cellula cigliata e’ meccanicamente sintonizzata per rispondere al meglio ad una data frequenza

21. Natura molecolare dei tip links • Identificati con la proteina caderina 23 (cdh23) • Assenza di cdh23: problemi acusticovestibolari • Anticorpi diretti verso cdh23 marcano I tip links • Dimensioni di cdh23 = a quelle dei tip links Problema: L’apparato di meccanotrasduzione e’ elastico, mentre cdh23 e’ rigida

22. I canali di meccanotrasduzione • Canali cationici nonselettivi • Molto permeabili al Ca2+ • Identificati con TRPA1 nei mammiferi • Possibile contributo di TRPN1 nei vertebrati inferiori • Entrambi I canali hanno domini di ancorina (17 per TRPA1 e 29 per TRPN1) • Il canale e’ fissato alla membrana in modo elastico Domini di ancorina in un canale TRP

23. Regolazione del Ca2+ nelle stereociglia • Proteine citoplasmatiche che legano il Ca2+ espresse in modo variabile • Isoforme diverse di PMCA nelle stereociglia (PMCA2) e nel soma (PMCA1)

24. La corrente di meccanotrasduzione • I canali MET sono nonselettivi • Composizione dell’endolinfa simile al citoplasma: • 100 mM K • 20 mM Na • 100 mM Ca • Il potenziale di membrana delle cellule ciliate e’ negativo • La corrente e’ quasi completamente portata dal K ma e’ depolarizzante • Il Ca2+ entra per gradiente di concentrazione

25. Il potenziale di recettore • La corrente MET depolarizza la cellula (Vz variabili tra -80 mV e -40 mV) • La depolarizzazione apre i canali del Ca2+ presinaptici • La cellula rilascia neurotrasmettitore • La fibra afferente si attiva • La chiusura e l’adattamento dei canali MET e l’attivazione di canali ionici basolaterali ripolarizzano la cellula ciliata, arrestando il rilascio del neurotrasmettitore.

26. Eterogeneita’ nelle cellule ciliate • Tutte le cellule ciliate possiedono un apparato ciliare • Le componenti della meccanotrasduzione appaiono simili in tutte le cellule ciliate • La sensibilita’ dell’apparato ciliare varia: • Diversa geometria (lunghezza, spaziatura stereociglia) • Diverso numero di canali MET • Diverse proprieta’ dei canali MET • Diverso metabolismo del Ca2+ • Variazioni molto piu’ radicali nel polo sinaptico: • Correnti ioniche • Metabolismo del Ca2+ • Numero e tipo di sinapsi

27. Il potenziale di recettore Il potenziale di riposo delle cellule ciliate e’ compreso tra -80 e -40 mV Le correnti di Ca2+ voltaggio-dipendenti presinaptiche si attivano a -60 mV e hanno il picco a -20 mV Potenziali di recettore utili per la trasmissione del segnale alla sinapsi afferente saranno compresi tra -60 e -20 mV

28. Scarica afferente vestibolare Attività a riposo Attività evocata La scarica a riposo delle fibre afferenti è dovuta al rilascio di glutamato dalla cellula ciliata al suo potenziale di riposo (più positivo della soglia di attivazione delle correnti di Ca)

29. Glutamato Al SNC Il potenziale di recettore provoca l’apertura dei canali del Ca2+ presinaptici e il rilascio di glutamato al terminale afferente attiva canali del K+ che ripolarizzano la cellula In alcuni casi attiva canali del Na+

30. Risonanza elettrica • Nei vertebrati inferiori, il potenziale di membrana delle cellule ciliate acustiche oscilla spontaneamente • La frequenza di oscillazione elettrica varia insieme a quella meccanica dell’apparato ciliare • I due meccanismi producono una precisa sintonizzazione di ciascuna cellula ad una data frequenza

31. Risonanza elettrica • La risonanza e’ dovuta alla interazione tra canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti e canali del K+ Ca-dipendenti • Le proprieta’ dei canali delle cellule ciliate acustiche sono distribuite in maniera tonotopica lungo la coclea • Cellule a f0 piu’ alta hanno correnti di Ca piu’ ampie e canali BK piu’ veloci • 7 siti di splicing alternativo per I canali BK

32. Risonanza elettrica • Nei mammiferi la risonanza elettrica non e’ stata osservata – meccanismo attivo addizionale dovuto alla elettromotilita’ delle OHC • Nel sistema vestibolare la sintonizzazione ad una data frequenza non serve • Non e’ chiaro se I feedback meccanici funzionino in modo simile che nel sistema acustico • E’ possibile che le correnti ioniche delle cellule vestibolari servano a smorzare la risonanza meccanica dell’apparato meccanosensibile

33. Risonanza e cellule vestibolari • Le cellule vestibolari esprimono una grande varieta’ di correnti di K • La corrente IA potrebbe essere implicata nello smorzamento delle oscillazioni nella corrente MET generate dai feedback negativi • Le correnti delayed rectifier potrebbero regolare il guadagno della cellula

34. Cellule di tipo I e di tipo II • Nel sistema vestibolare degli amnioti si trovano le cellule di tipo I, caratterizzate da una sinapsi a calice • Le cellule di tipo II si osservano in tutti I vertebrati