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Bactériologie des eaux. plan. I. Les méthode générales de prélèvement et analyses II. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes fécaux II.3 Streptocoques fécaux II.4 Clostridium sulfito -réducteurs II.5 Bactériophage

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Presentation Transcript
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plan

I. Les méthode générales de prélèvement et analyses

II. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale:

II.1 Coliformes totaux

II.2 Coliformes fécaux

II.3 Streptocoques fécaux

II.4 Clostridiumsulfito-réducteurs

II.5 Bactériophage

III. Recherche et dénobrement des germes pathogènes

IV. Principaux maladies à transmission hydrique

introduction
INTRODUCTION

L’objectif de l’analyse bactériologique

d’une eaux n’est pas d’effectuer un inventaire

de toutes les espèces présentes, mais de

rechercher soit celle qui sont susceptibles d’etre

pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de

contamination fécales.

L’analyse débute par l’acte de prélèvement qui

doit mettre en œuvre des méthodes assurant

l’absence de contamination et la survie

bactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodes

générales d’examen bactériologique des eaux suivies

des recherches de bactéries indicatrices de pollution

et d’éfficacitée de traitement puis des bactéries

spécifiques pathogènes

i i m thodes de pr l vement
I.I méthodes de prélèvement

Matériel de prélèvement :

  • flacon en verre (borosilicaté de préférence) de 250 à 1000 ml.
  • flacon en plastique à usage unique stérilisés par le fabriquant.
  • Appareils de prélèvement :
    • Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en cas de prélèvement d‘eau un puits, au centre d’un cours d’eau, en profondeur dans un lac, on doit utiliser des appareils tel que le plongeur et la canne à prélèvement.
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plongeur

Canne à prélèvement

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Mode de prélèvement

  • En fonction de la nature des eaux analysées et celle des micro-organismes recherchés, les normes fixent des conditions à respecter (volume de l’échantillon, agent neutralisant, qualité du matériel d’échantillonnage…..)
  • L’objectif est d’obtenir un échantillon aussi représentatif que possible de l’eau à examiner, sans contaminer ni modifié l’échantillon.
  • Des précautions doivent être prises à trois niveau:
        • Le matériel de prélèvement
        • Le mode de prélèvement
        • Le transport la conservation des échantillon
m thodes g n rales de d nombrement
Méthodes générales de dénombrement

En milieu liquide

en milieu solide

Méthode de détermination du nombre le plus probable (PPN)

Méthode par incorporation

Méthode par étalement

Méthode par filtration

m thodes en milieu solide
Méthodes en milieu solide

Méthode par incorporation:

Principe:

L’échantillon d’eau à analyser est mélanger au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi une à T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées.

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Mode opératoire

3)faire un mouvement de rotation

.

2) Incorporer le milieu en surfusion

1) volume d'eau à ensemencer ( 1 ml)

Incuber

Faire le dénombrement

m thode par talement
méthode par étalement

Principe:

L’échantillon d’eau à analyser est étaler à la

Surface d’un milieu gélose sans trace

d’humidité: après incubation, les colonies qui

se développent à la surface sont

dénombrées.

mode op ratoire
Mode opératoire

Etaleur stérile (râteau)

Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml

  • Incuber
  • Dénombrer les colonies développer à la surface
m thode par filtration
Méthode par filtration

Principe:

L’échantillon d’eau à analyser est filtré à

Travers une membrane qui retient les micro

organisme. La membrane est ensuite placée

sur un milieu gélosé. Durant l’incubation, des

colonies se forment à la surface de la

membrane

technique de d nombrement en milieu liquide
Technique de dénombrement en milieu liquide

Principe générale:

Les prise d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses

Dilution sont incorporées dans un milieu liquide conçu

Pour permettre la croissance d’un micro-organisme

ou de groupe de microorganismes. la croissance se

traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et,

éventuellement, une modification visible ( virage d’un

indicateur de pH coloré)

m thode du nombre le plus probable
Méthode du nombre le plus probable

Principe:

Cette méthode est une estimation statistique du

nombre de micro-organisme supposés distribués dans

l’eau de manière parfaitement aléatoire. L’estimation

de la densité bactérienne est obtenue par

application du principe de vraisemblance, à partir de

réponses positives observées pour une ou plusieurs

dilution successives de la suspension bactérienne

originelle. Il s’agit d’une méthode quantique et non

pas énumératif.

mode op ratoire1
Mode opératoire
  • On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en micro plaque).
  • On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-organisme.
  • Il doit être tenu compte que si l’absence de culture correspond à l’absence de micro-organisme, plus d’un micro-organisme peut être responsable d’une culture positive.
  • Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance).
d nombrement des germes t moignant d une pollution f cale
Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale

Notion d’indicateur

comme l’origine de la plupart des micro-organismes

pathogènes véhiculés par l’eau est fécale,

le principe du contrôle de la qualité de l’eau repose

sur la démonstration que l’eau distribuée ne contient

pas de germes provenant de contamination fécale.

Pour cela, on recherche des indicateurs de contamination

fécale, appelés aussi germes témoins de contamination

fécale. On parle également d’indicateurs de traitement qui

permettent d’évaluer l’efficacité des différents traitements

De potabilisation mis en œuvre vis-à-vis de différents

germes.

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Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature :

  • Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et l’apparition d’infection dans une population.
  • Ecologique : il doit être spécifique d’une contamination fécale : systématiquement rencontré lorsqu’il y a présence de féces d’animaux à sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollués. Il doit être sensible : il doit être mis en évidence dans l’eau lorsque des pathogènes sont présents, et ce en grand nombre.
  • Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans l’eau.
  • Technique : il doit être facile et rapide à détecter, et ce, à moindre cout.
d nombrement des micro organismes revivifiables
Dénombrement des micro-organismes revivifiables

Définition:

On entend par microorganismes : Bactéries, Levures,

Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai

est effectué selon la méthode spécifiée.

Le principe consiste à mettre en évidence les bactéries

  • Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les germes spécifiques de l’eau.
  • Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes issus de l’homme et des animaux à sang chaud.
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dans les milieux de très bonne qualité microbiologique pour contrôler une possible contamination bactérienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrôlées.

  • Dans l’usine de potabilisation, il permet de contrôler l’efficacité des différentes étapes du traitement.
  • dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne après la station de traitement peut être le signe d’une multiplication bactérienne dans le réseau ou d’une intrusion de bactéries à l’intérieur de celui-ci.
  • Dans les réservoirs et châteaux d’eau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualité de l’eau et sur la reviviscence des germes
recherche et d nombrement des coliformes totaux et f caux
Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux

Définitions:

Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C.

Ils se répartissent en fait en deux catégories :

  • Les germes d’origine fécale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia.
  • Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacterintermedium et Amnigenus, klebsiellaterrigena.
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Intérêt:

  • la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C :intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une contamination fécale sure
  • coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe l’existence quasi certaine de la contamination fécale.
  • La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux.
recherche et d nombrement des streptocoques f caux ou ent rocoque
Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux ou entérocoque

Définition :

bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes,

formant des chainettes, non sporulées, catalase

négative, possédant l’antigène D, cultivant en

anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables

d’hydrolyser l’esculine en présence de bile.

Ils se répartissent en deux genres :

  • streptococcus
  • et enterococcus.
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Intérêt:

  • les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau plus ancienne.
  • La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale d’une eau.
  • Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcusfeacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés.
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Recherche et dénombrement des spores des bactéries sulfito-réductrices et clostridiumsulfito-réducteurs

Définitions:

Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices:

formes de résistance de micro-organismes se

développant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou

48h en gélose viande foie et donnant des colonies

typiques réduisant le sulfite de sodium.

Spores de clostridiumsulfitoréducteurs : même

définition que la précédente pour des bacilles à Gram

positif, ne possédant pas de catalase et ayant

l’aspect morphologique des clostridium.

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Intérêt:

  • ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste.
  • L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection.
  • Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium.
iii m thode de recherche et d nombrement des germes t moignant d une pollution f cale
III. Méthode de recherche et Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale:
iv recherche des bact ries pathog nes
IV. Recherche des bactéries pathogènes

IV.1 Recherche de salmonella

Définition:

    • Des bacille Gram négatifs
    • (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir.
  • Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques.
m thode de recherche
Méthode de recherche

Pré-enrichissement

Enrichissement primaire

Enrichissement secondaire

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Lecture et interprétation :

  • Repérer les colonies caractéristiques.
  • Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC…
  • Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de référence.
recherche de vibrion chol rique
Recherche de vibrion cholérique

Définition:

  • Bacille Gram négatif droits ou incurvés,
  • Très mobiles,
  • Oxydase (+),
  • AAF,
  • Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S, Hautement pathogènes.
recherche de staphylocoques coagulase positive
Recherche de Staphylocoques à coagulase positive :

Définition:

    • Cocci à Gram (+)
    • Isolées ou en grappes de raisin,
    • Catalase (+) et coagulase (+)
    • (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol.
  • L’espèce type du genre est Staphylococcusaureus. Elle est pathogène et très redoutée.
recherche de pseudomonas a rog nosa
Recherche de Pseudomonasaérogénosa

Définition:

    • Un bacille Gram négatif
    • Oxydase (+)
    • Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide.
  • Pseudomonasaeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.