Oncologia Sperimentale di laboratorio

1. Oncologia Sperimentale di laboratorio METASTASI SPERIMENTALI RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO IN VIVO 6° S. Beninati

2. Modelli sperimentali in vivo • Permettono di valutare due parametri: • proliferazione • Colonizzazione/invasione

3. IL MODELLO ANIMALE • SONO UTILIZZATI DIVERSI MODELLI ANIMALI PER RIPRODURRE IL PROCESSO METASTATICO E LA SUCCESSIVA INVASIONE E COLONIZZAZIONE DELL’ORGANO BERSAGLIO • I MODELLI CHE SI USANO COMUNEMENTE PERMETTONO DI INOCULARE CELLULE TUMORALI DIRETTAMENTE NELL’ANIMALE IN DIVERSE PARTI DEL CORPO: • INTRAMUSCOLO INTRASPLENICA • INTRAPERITONEALE ENDOVENA • INTRAOCULARE SOTTOCUTANEA

5. Parametri: Volume,Peso,Aspetto, angiogenesi, necrosi Tumore primario indotto con inoculo intramuscolare di cellule di melanoma murino

6. MODELLI ANIMALE DI MELANOMA • Due modelli animali sono utilizzati per lo studio del melanoma: • Il modello polmonare • Il modello splenico

7. Animali • I topi del ceppo C57BL/6 sono utili se si usano linee cellulari di melanoma murino (B16-F10;B16-FLr6) • Utilizzando topi singenici, cioè dai quali sono state ottenute le linee tumorali, è ridotto drasticamente il fenomeno del rigetto. • *individui della stessa specie che sono geneticamente identici, per esempio animali dello stesso ceppo consanguineo. Cellule proveniente da individui singenici possono essere usate per modelli di trapianto d'organo e tumorali.

8. C57BL/6

10. Modello splenico • Una sospensione di cellule di melanoma viene iniettata direttamente nella milza dell’animale. • Le cellule di melanoma passano in circolo e invadono il fegato. • Le metastasi sono visibili poichè ricche di melanina nera.

11. Modello Polmonare • Le cellule di melanoma murino C57BL/6 sospese nel mezzo di coltura vengono iniettate endovena nella vena caudale dell’animale. • Attraverso il circolo raggiungono un solo organo bersaglio: il polmone • Anche in questo caso le metastasi sono visibili poiché ricche di melanina.

12. metastasi Polmone di topo C57BL/6 invaso da cellule tumorali di melanoma B16-F10

13. Valutazione del potere metastatico • E’ possibile valutare il numero di metastasi superficiale per mezzo di una conta visiva. Il metodo risulta empirico e poco preciso in particolare in presenza di un alto numero di metastasi. • E’ necessario considerare che l’organo bersaglio è invaso anche nel suo stroma interno. • Quindi la conta superficiale è sicuramente poco significativa

14. Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10 Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10 trattato con antineoplastici

15. Modello istologico di valutazione del potere metastatico • Per poter effettuare una conta delle metastasi attendibile è necessario considerare anche le metastasi interne. • A tal fine l’organo bersaglio viene sezionato in sottili fettine, per mezzo di un microtomo. • Il microtomo permette di ottenere fettini sottilissime e trasparenti, denominate “sezioni istologiche seriate”

16. Sezioni istologiche seriate di polmone di topo C57BL/6 inoculato con cellule B16-F10

17. Analisi di immagine computerizzata • Ogni singola sezione viene analizzata al computer con un software adatto per la misura di cinque parametri principali: • 1. area della sezione istologica • 2. area delle metastasi • 3. numero di metastasi • 4. area occupata dalle metastasi • 5. percentuale di colonizzaione

18. Elaborazione morfometrica • Il computer elabora i parametri precedenti e il risultato permette di valutare: • 1. area totale della sezione istologica (TA) • 2. area media di una metastasi (AAMF) • 3. area metastatica totale (TMA)

19. Invasione e proliferazione • IL modello di calcolo nasce da due considerazioni: • La cellula tumorale invade l’organo bersaglio e quindi inizia a proliferare. • L’invasione può essere valutata considerando il numero di metastasi • Mentre la proliferazione valutando le dimensioni delle metastasi

21. Elaborazione dei dati • L’analizzatore di immagini permette quindi di calcolare: • L’area totale della sezione istologica TA • L’area metastatica totale MTA • L’area media di una metastasi AAMF. • Attraverso questi parametri si ricavano tre indici.

22. Indice di invasione • Il rapporto • TMA/AAMF • Si definisce Indice di Invasione o “Invasion Index” (II) • II=TMA/AAMF • TMA= area metastatica totale • AAMF= area media di una metastasi

23. Invasione • Infatti il rapporto TMA/AAMF definisce il numero di metastasi totale, poiché deriva da: • TMA= area metastatica totale • AAMF= area media di una metastasi

24. Indice di proliferazione • Il rapporto • AAMF/TA • Si definisce come indice di crescita o “Growth Index” (GI) • GI=AAMF/TA • AAMF= area media di una metastasi • TA= area totale della sezione istologica

25. Indice di colonizzazione • Il rapporto • TMA/TA x 100 • Esprime la percentuale di colonizzazione, indicando quanta area è stata occupata dalle metastasi. Si indica come %CI • TMA= area metastatica totale • TA= area totale della sezione istologica

27. Applicazione pratica Due molecole con potenziale attività antineoplastica sono state saggiate e hanno dato i seguenti indici: Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index) Controllo 33,6 110 30,6 Teofillina (TH) 7,9 90 7,5 Controllo 33,2 110 150,0 Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0 Colonizzazione proliferazione invasione

28. teofillina • Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index) • Controllo 33,6 110 30,6 • Teofillina (TH) 7,9 90 7,5 • -76,5% -18% -75,5% • % di: colonizzazione proliferazione invasione • La molecola risulta essere antimetastatica e poco antiproliferativa

29. Beta-teofillina • Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index) • Controllo 33,2 110 150,0 • Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0 • % di: -82,8% 0% -84% • colonizzazione proliferazione invasione • La molecola risulta essere altamente antimetastatica e non influenza la crescita tumorale

30. Confronto fra molecole • E’ possibile comparare gli indici di varie molecole potenzialmente antineoplastiche. • In tal modo si può utilizzare un farmaco mirato per il tipo di tumore.