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Progetto Biotechnologies. Prof.ssa montemarani E Prof.ssa goia. Lavoro a cura di Martina Ballatore. Indice. Appunti del corso Approfondimenti: Bioetica Topi transgenici Cellule staminali 1 – 2 La clonazione 1 – 2 Terapia genetica 1 – 2 Microrganismi patogeni

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Presentation Transcript
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Progetto

Biotechnologies

Prof.ssa montemarani

E

Prof.ssa goia

Lavoro a cura di Martina Ballatore

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Indice

  • Appunti del corso
  • Approfondimenti:
    • Bioetica
    • Topi transgenici
    • Cellule staminali 1 – 2
    • La clonazione 1 – 2
    • Terapia genetica 1 – 2
    • Microrganismi patogeni
  • Laboratorio di inglese:
    • Gel electrophoresis
    • DNA Extraction
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Appunti

Biotecnologie

Martina Ballatore

Clarissa Rebaudo

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Clonazione dei geni

I passaggi fondamentali della clonazione dei geni (amplificazione della sequenza di DNA):

  • Il gene da clonare viene inserito in una molecola di DNA circolare chiamata vettore, per produrre una molecola di
  • DNA ricombinante.
  • Il vettore trasporta il gene in una cellula ospite, che generalmente è un batterio perché prolifica rapidamente.
  • Il vettore si moltiplica dentro alla cellula ospite, producendo numerose copie uguali
  • Quando la cellula ospite si divide, alla progenie vengono passate copie della molecola di DNA
  • ricombinante e il vettore si replica ulteriormente.
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PCR

  • La PCR si svolge in una singola provetta, mescolando DNA con una serie di reagenti, che poi sarà inserita in un termociclatore (strumento che permette di incubare la miscela a una serie di temperature diverse).
  • Le fasi della PCR:
  • La miscela che vado a considerare (incognita) viene scaldata a 90°, in modo tale che i legami a idrogeno vengano separati.
  • La miscela viene raffreddata a 50°, i filamenti di ogni molecola possono unirsi, ma non lo fanno perché i primer si attaccano alla molecola di DNA.
  • La temperatura viene alzata a 70° e si ha una sintesi di DNA, quattro filamenti di DNA invece che due.
  • La temperatura viene alzata a 90°,le molecole a doppio filamento si denaturano in singoli filamenti. Riinizia il ciclo e si ottengono otto filamenti.
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Studio dei prodotti della PCR

La PCR è il punto di partenza per una lunga serie di esperimenti in cui il prodotto dell’amplificazione è studiato in vari modi per ottenerre informazioni sulla molecola di DNA che ha agito da stampo iniziale. Le tre tecniche più importanti per studiare i prodotti della PCR sono:

Elettroforesi in gel dei prodotti della PCR

1

Clonazione dei prodotti della PCR

2

Sequenziamento dei prodotti della PCR

3

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Manipolazione di DNA purificato

Una volta che sono stati preparati i campioni di DNA puri, bisogna costruire la molecola di DNA ricombinante

tagliando il suo vettore e la molecola in punti specifici.

Queste manipolazioni sono alla base della clonazione di un gene, e necessitano tutte di enzimi purificati

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Enzimi di manipolazione di DNA

Nucleasi

1

Ligasi

2

Polimerasi

3

Enzimi di modificazione

4

Topoisomerasi

5

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Nucleasi

Sono enzimi che tagliano, accorciano o degradano molecole di acidi nucleici, catalizzando l'idrolisi del legame fosfodiesterico. Ne esistono di due tipi:

Esonucleasi

1

idrolizzano il DNA partendo dai nucleotidi situati alle estremità dei filamenti

Endonucleasi

tagliano direttamente all'interno

del filamento

2

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Ligasi

Uniscono insiemi molecole di acidi nucleici a formarne una terza attraverso un nuovo legame chimico, spesso accompagnato dall'idrolisi di una molecola come ATP.

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Polimerasi

Producono copie di molecole. La maggior parte delle polimerasi può funzionare soltanto se lo stampo possiede una regione a doppio filamento che agisce da primer per l’inizio della polimerizzazione degli acidi nucleici, come DNA e RNA.

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Enzimi di modificazione

Rimuovono o aggiungono gruppi chimici modificando

la struttura di molecole di DNA. I più importanti sono:

Fosfatasi alcalina

1

Rimuove il gruppo fosfato presente al terminale 5’

Polinucleotide chinasi

2

Aggiunge il gruppo fosfato sul terminale 5’

Deossinucleotidil trasferasi terminale

3

Aggiunge dei deossiribonuclotidi al terminale 3’

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Polimerasi

Introducono o rimuovono superavvolgimenti da molecole di DNA circolare chiuso covalentemente

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Enzimi che tagliano il DNA:

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

La clonazione dei geni richiede che le molecole di DNA siano tagliate in maniera precisa. Ogni molecola di vettore dev’essere tagliata in una singola posizione, per aprire il cerchio in modo da poter inserire nuovo DNA, ma spesso è anche necessario tagliare il DNA che dev’essere clonato. Per tagliare le molecole di DNA in maniera precisa e riproducibile vengono usate le endonucleasi di restrizione. Ne esistono di tre tipi e si distinguono per una modalità di azione leggermente diversa. Per la clonazione dei geni vengono usati soprattutto quelli di II tipo, perché ciascun enzima di questa classe possiede una sequenza di riconoscimento specifica a livello della quale taglia una molecola di DNA. Per determinare il numero e le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dal taglio bisogna effettuare l’analisi di restrizione, mentre per selezionare le corrette endonucleasi di restrizione per le particolari manipolazione di taglio si usa la mappa di restrizione.

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Unione di molecole di DNA:

LEGATURA

Il passaggio finale della costruzione di

una molecola di DNA ricombinante è l’unione

della molecola del vettore con il DNA da clonare,

Legatura, e l’enzima che catalizza la reazione

è il DNA ligasi.

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Preparazione di DNA cellulare totale

  • Il processo di preparazione di DNA completo avviene in 4 fasi:
  • Una coltura di batteri viene fatta crescere e quindi raccolta (grazie ai brodi di cultura, tipo agar, estratti di amminoacidi). Gli elementi sempre presenti nei brodi di cultura:
  • cloruro di sodio (perché è il sale)
  • solfato di magnesio
  • glucosio
  • Le cellule vengono aperte per provocare il rilascio del loro contenuto (vengono aperte con la soluzione ipertonica)
  • Questo estratto cellulare viene trattato per rimuovere i componenti tranne il DNA
  • La soluzione risultante di DNA viene concentrata (precipitazione in etanolo)
  • Un altro metodo per la preparazione del DNA è la centrifugazione per sedimentazione del dna (in fondo alla provetta perché è più pesante della soluzione).
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Preparazione di DNA plasmidico

Il procedimento di purificazione è lo stesso di quello del DNA cellulare totale. La preparazione di DNA plasmidico prevede la separazione di una piccola quantità di DNA circolare separandolo da quello genomico, molto più abbondante. Questo metodo di separazione avviene in base alle dimensioni e alla conformazione. Anche il DNA plasmidico può essere separato tramite centrifugazione e cromatografia.

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BIOTECNOLOGIE

IN

MEDICINA

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Terapia Genica

La terapia genica è l'inserzione di materiale genetico (DNA) all'interno delle cellule al fine di poter curare delle patologie. Questa procedura di inserzione è nota come transfezione.

Esistono due tipologie di terapia genica: quella delle cellule germinali e quella delle cellule somatiche.

  • La prima si propone di trasfettare le cellule della linea germinale come spermatozoi ed ovociti o le cellule staminali totipotenti dei primissimi stadi dello sviluppo dell'embrione (allo stadio di 4-8 cellule), ma attualmente essa non viene messa in pratica sia per ragioni tecniche ma soprattutto per i grandissimi dilemmi etici cui si può andare incontro.
  • La seconda tipologia, invece, si propone di modificare solamente le cellule somatiche, senza intaccare, quindi, la linea germinale ed oggigiorno è la via più studiata e tentata. La terapia genica delle cellule somatiche, a sua volta, viene suddivisa in due gruppi: la terapia genica ex vivo e quella in vivo.
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Quali sono le malattie genetiche che sono state studiate

con il metodo delle sonde geniche/molecolari?

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Fibrosi cistica, malattia polmonare

  • Corea Hungtinton, neuro-degenerazione
  • Distrofia muscolare
  • Anemia
  • Fenilctunuria (TKU), degenerazione che
  • provoca urine scure e si risolve il problema non
  • mangiando prodotti con la fenilalanina
  • Talassemia
  • Retinoblastoma
  • Tais Ax
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L'OGM

Gli organismi geneticamente modificati sono animali, piante o microrganismi il cui patrimonio genetico, o geoma, è stato modificato introducendo un gene preso da un altro organismo.

Gli organismi geneticamente modificati vengono prodotti e studiati per migliorare alcune caratteristiche della produzione di beni agricoli e animali, per migliorarne alcune caratteristiche. In alcuni di essi sono stati prodotti per sopperire a carenze alimentari o per diffondere in maniera economica dei vaccini. il loro impiego dunque rappresenta un grande avanzamento tecnologico.

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aumento delle coltivazioni ogm

  • Il seguente grafico illustra l’ aumento delle coltivazioni OGM nel corso degli anni.
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che cos'è la biotecnologia e cosa c'entra con gli ogm?

  • la biotecnologia è un processo mediante il quale si sfruttano le caratteristiche di un organismo per ottenere un determinato effetto.
  • I vantaggi di queste tecniche sono evidenti a tutti, specialmente nel campo dell’agricoltura: si potrebbero ottenere piante in grado di resistere in particolari condizioni climatiche con grande risparmio denaro, tempo e aumento del rendimento.
  • Questo potrebbe significare la soluzione del problema della fame nei paesi sottosviluppati, inoltre in questo modo si potrebbe ridurre l’inquinamento da pesticidi o da fertilizzanti
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i detrattori dell'ogm

  • I detrattori dell’OGM sottolineano invece come ogni variazione dell’ordine naturale potrebbe condurre a risultati catastrofici. Molti ancora sostengono che l’utilizzo di questi organismi, in quanto effetto di mutazioni genetiche, potrebbe portare a malattie che causano a loro volta mutazioni genetiche nell’organismo delicato di chi se ne ciba, come tumori infantili.
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le biotecnologie

  • Con il termine biotecnologie si intendono quelle tecnologie che utilizzano organismi viventi o loro componenti per ottenere quantità commerciali di prodotti utili oppure per migliorare le caratteristiche di piante, animali o, ancora per sviluppare microrganismi utili per usi specifici. Le principali applicazioni delle biotecnologie si registrano nei settori:
  • Farmaceutici e di medicina, per la produzione di prodotti diagnostici e medicinali
  • Agricoltura veterinaria e zootecnia
  • Bioindustria, per la produzione industriale di vitamine, aminoacidi, enzimi e prodotti alimentari
  • Ambientale per lo smaltimento dei rifiuti, la depurazione delle acque del suolo e dell’ area
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cos'è l'ingegneria genetica

  • L’ingegneria genetica permette di programmare i microrganismi e di assegnare loro nuove funzioni.
  • Partendo dalla copia della proteina umana che si intende produrre attraverso il batterio ricombinante inserito in una molecola di DNA si arriva all’estrazione delle proteine che i batteri hanno prodotto.
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quando sono nate le biotecnologie tradizionali?

  • Le biotecnologie tradizionali, intese semplicemente come utilizzazione di organismi viventi, risalgono ai tempi preistorici; il latte che si trasforma in formaggio, il succo d’uva in vino, sono un esempio di biotecnologie tradizionali che si usavano già da tanti secoli.
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quando sono nate le biotecnologie avanzate?

  • L’origine delle biotecnologie avanzate può essere fatta risalire al 1680 quando, Anton Von Leewenhoek riuscì per primo a vedere i batteri grazie alla costruzione di un microscopio. Successivamente gli scienzati Pasteur, Crick, Wotson e Berg grazie ai loro studi e alle loro scoperte posero le basi delle moderne biotecnologie avanzate. Il primo traguardo di questo progetto fu nel 1982 quando fu immesso sul mercato il primo biofarmaco (l’insulina) prodotta grazie all’ingegneria genetica.
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i rischi delle biotecnologie

  • I rischi delle biotecnologie sono per l’opinione pubblica limitati all’uso delle piante modificate. Queste vengono consumate su larga scala da più di un decennio senza mai riportare complicazioni di nessun tipo. Anche l’Agenda 21 riconosce come le biotecnologie possono contribuire allo sviluppo internazionale solo se queste vengono sviluppate ed applicate adeguatamente.
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Produzione di vaccini e di farmaci economici

Possibilità di diagnosticare o curare malattie il cui gene sia conosciuto

Possibilità di rilevare elementi patogeni negli alimenti

Abbassamento dei costi di riproduzione di farmaci e vaccini con relativo aumento della produzione

Aumento della quantità degli alimenti, miglioramento della qualità, della resistenza a stress ambientale, a parassiti e altri patogeni

Biorisanamento del suolo e delle acque inquinate da composti tossici

Possibilità di effettuare diagnostica ambientale.

i vantaggi delle biotecnologie

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le biotecnologie per l'ambiente

  • Le biotecnologie sono capaci di assicurare il corretto smaltimento dei rifiuti, l’ottenimento di prodotti puliti, la produzione di rifiuti ecocompatibili, la bonifica del suolo, acque e aria. Proprio nell’ultimo decennio per le biotecnologie definite ambientali si è venuta a creare una domanda di mercato di straordinarie dimensioni.
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Biotecnologie nello smaltimento dei rifiuti

Lo smaltimento dei rifiuti urbani, solidi e liquidi, oggi è un problema sociale. Le biotecnologie svolgono un ruolo molto importante perchè esaminano l’ intero ciclo di smaltimento e recupero dei rifiuti urbani.

Al giorno d’ oggi la moltitudine di sostanze chimiche nocive, come i bio-gas da discarica, compost, bio-gas da digestione anaerobica e i rifiuti liquidi urbani e industriali provocano un ingente inquinamento atmosferico.

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DNA Barcode

  • La tecnica più avanzata per classificare gli esseri viventi è detta PCR ed è frutto dello studio del DNA mitocondriale (mtDNA). La mirata analisi sul DNA mitocndriale è dovuta al fatto che esso è difficilmente modificabile; esistono inoltre dei vantaggi:
  • è di dimensioni ridotte
  • è trasmissibile per eredità materna
  • Un problema può essere costituito dalle mutazioni, a cui possono essere soggetti i geni depistando il riconoscimento della specie. Per fronteggiare il problema si preferisce utilizzare il gene CO1 presente nel mtDNa grazie al quale si posso distinguere specie diverse anche in individui apparentemente simili.
  • La tecnica del DNA Barcode viene utilizzato per stabilire la data di morte degli individui esaminando gli insetti presenti sul cadavere e anche nel sottore alimentare al fine di evitare frodi commerciali.
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il codice a barra utilizzato per l'identificazione della specie

  • Come illustrato nella seguente immagine, si può osservare, come il codice a barra venga utilizzato per confrontare le sequenze che si ottengono in laboratorio, con quelle di migliaia di specie memorizzate in una banca dati pubblica.
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Lavoro realizzato da:

  • Esposito Alessandra II E
  • Chinetti Simone II E
  • Manco Gennaro II E
  • Rubino Stefano II E
topi transgenici

TOPITRANSGENICI

C:\

Cinzia Buccella

introduzione
Introduzione
  • Lo sviluppo delle tecnologie dell’ ingegneria genetica negli ultimi venti anni ha permesso di mettere a punto metodologie per modificare geneticamente gli animali.
  • Questo può essere fatto in modi differenti per ottenere risultati diversi:

-A livello locale, nel topo adulto, si utilizzano particolari strategie

(vettori virali e DNA nudo) che permettono di modificare le cellule di un determinato tessuto,con un efficienza molto variabile a seconda del tipo di tessuto,del gene e del vettore.

-Nell’ interno dell’ animale agendo sulle cellule staminali-embrionali o sullo zigote(cellula risultante dalla fecondazione della cellula uovo con lo spermatozoo).

topi transgenici51
TOPI TRANSGENICI
  • I topi transgenici sono relativamente semplici da ottenere e hanno dato in passato risposte ad importanti domande della biologia e della biologia. Un motivo per cui sono spesso utlizzati è per vedere cosa accade in presenza di geni con funzionamento anomalo, oppure per identificare in che momento, in che luogo e in base a quali stimoli sono attivati certi geni. Il transgene è prodotto con le tecniche della biologia molecolare, e comprende normalmente quattro porzioni di DNA unite insieme: una sequenza regolatoria (il promotore), che permette l’attivazione del gene, il gene d’interesse, due sequenze con funzione di stabilizzazione(un introne e una sequenza per la poliadenilazione dell’mRNA.
topi knock out
TOPI KNOCK–OUT
  • I topi knock–out sono divenuti molto utili nel contribuire a capire il genoma umano ed il relativo ruolo nelle malattie. Generando un knock-out è stato dimostrato che è possibile mirare l’inserimento del gene in una posizione precisa del genoma del topo; ciò dà la possibilità di eliminare un gene specifico con un allele inattivo o mutato. Di conseguenza gli animali Knock-out sono considerati una tecnica investigativa che tiene conto dell’eliminazione di un gene in particolare, nel tentativo di definire che effetto ha

nell’ organismo.

microiniezione di dna e produzione di topi transgenici
MICROINIEZIONE DI DNAE PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI
  • Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” ( mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici ; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto.
cellule es
CELLULE ES
  • Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti (cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione.
iniezione del dna ricombinato
INIEZIONE DEL DNA RICOMBINATO
  • Le cellule staminali che hanno integrato nel loro genoma il DNA ricombinato, vengono iniettate in un embrione isolato in stadio precoce di sviluppo.
  • L’embrione precoce, composto parzialmente da cellule ES, viene introdotto nell’utero di una femmina pseudogravida.
  • Il topo “chimera” che si sviluppa da questo embrione conterrà alcune cellule somatiche portatrici del gene alterato e conterrà anche cellule della linea germinale che portano il gene modificato.
topo chimera incrociato con topo normale
TOPO CHIMERA INCROCIATO CON TOPO NORMALE
  • Il topo “chimera” verrà incrociato con un topo normale e alcuni discendenti (2 su dieci) avranno un gene modificato in tutte le loro cellule ( eterozigosi).
  • Incrociando tra loro questi topi portatori del gene modificato si ottiene qualcuno dei discendenti contenente 2 geni alterati in tutte le sue cellule (omozigosi ).
  • Se l’alterazione genica originale inattiva completamente la funzione genica si avranno allora dei topi ad “eliminazione” (Knock-out) cioè ceppi di topi che hanno un certo gene inattivato definitivamente.
uso del knock out nella colorazione del pelo di topo
USO DEL KNOCK-OUT NELLA COLORAZIONE DEL PELO DI TOPO
  • Le cellule ES utilizzate hanno uno “STRAIN” con pelo di colore bianco. Dopo che tali cellule sono state inserite in una blastocisti, esse si divideranno in molti tessuti differenti. Se il risultato è un topo che il pelo con macchie bianche e macchie nere vuol dire che l’iniezione di cellule ES è riuscita. Dopo l’individuazione dei topi che hanno avuto contributi da entrambi i tipi di cellule, si ha la trasmissione della germ-line per cui dall’incrocio di questi topi eterozigoti con il pelo a chiazze avremo la nascita di topi Knock-out con il pelo nero ( quindi genotipo omozigote)
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Le cellule staminali

Le cellule staminali sono cellule primitive non specializzate dotate della singolare capacità di trasformarsi in qualunque altro tipo di cellula del corpo. Molti ricercatori sostengono che le cellule staminali potranno potenzialmente rivoluzionare la medicina, permettendo ai medici di riparare specifici tessuti o di riprodurre organi.

Per poter essere definita come staminale una cellula deve soddisfare le seguenti proprietà:

Autorinnovamento:capacità di compiere un numero illimitato di cicli replicativi mantenendo il medesimo stadio differenziativo

Potenza: capacità di dare origine a una o più specie cellulari

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Differenti tipi di cellule staminali:

In base alla potenza si possono distinguere quattro tipi di cellule staminali:

-Una singola cellula staminale totipotente può svilupparsi in un intero organismo e persino in tessuti extra-embrionali. I blastomeri posseggono questa proprietà.

- Le cellule staminali pluripotenti, come le iPs, possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.

-Le cellule staminali multipotenti sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.

-Le cellule staminali unipotenti possono generare solamente un tipo di cellula specializzata.

Le cellule staminali si classificano anche secondo la provenienza, come adulte o embrionali

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Applicazione delle cellule staminali:

Grazie alle cellule staminali e' possibile riuscire a riprodurre una malattia in laboratorio, studiarne i vari aspetti e ipotizzare possibili terapie. E' quello che ha fatto un gruppo di ricercatori delle università del Wisconsin-Madison e del Missouri-Columbia in uno studio pubblicato sulla rivista Nature. Gli scienziati hanno riprogammato le cellule prelevate dalla pelle di un bimbo colpito da atrofia muscolare spinale, malattia genetica neurodegenerativa. In laboratorio le cellule si comportano esattamente come nell'organismo colpito dalla patologia, dando l'opportunita' ai ricercatori di osservare il corso della malattia. Un'opportunita' del tutto nuova, resa possibile da un'altra scoperta, questa volta giapponese, che ha permesso di riprogrammare le cellule adulte in simil-embrionali. Oltre alle cellule del piccolo paziente, i ricercatori hanno prelevato quelle della madre sana. Le cellule sono state fatte crescere con successo e poi, grazie a una nuova tecnica, 'trasformate' in 'motoneuroni', che controllano i muscoli e che sono colpiti 'a morte' nelle persone con Sma. Inizialmente, i due campioni cellulari non hanno mostrato differenze, ma dopo un mese solo i 'motoneuroni' ottenuti dalle cellule del bimbo malato sono scomparsi. Il prossimo passo sarà ora capire che cosa uccide i 'motoneuroni' e perché queste cellule soltanto sono il bersaglio della malattia. Sarà possibile così sviluppare terapie per una patologia al momento senza cure. Lo stesso meccanismo, inoltre, potrà essere applicato ad altre malattie genetiche come la Corea di Huntington.

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2008:nuove scoperte.

  • Secondo l’autorevole rivista Science, la miglior scoperta 2008 per la medicina è la possibilità di riprogrammare le cellule staminali adulte per farle regredire allo stadio embrionale. Così facendo gli scienziati sono potenzialmente in grado di ricreare tutti i tessuti del corpo umano così come si sta già facendo con le embrionali.
  • Questo tipo di staminali ricreate in laboratorio hanno interessato gli scienziati di tutto il mondo sia per la loro capacità che per l’origine: in questo modo, infatti, non c’è alcun problema di carattere etico perché le implicazioni rappresentate dalle embrionali sono assenti.
  • La possibilità di riprogrammare le cellule in realtà risale a ben due anni fa, quando in una serie di esperimenti condotti sui topi, i ricercatori mostrarono che era possibile cancellare la memoria dello sviluppo di una cellula, inserendo quattro geni. Una volta tornate allo stadio embrionale, le cellule potevano essere trasformate in tipi completamente differenti.
  • Quest’anno, un’équipe di ricerca ha prelevato da un paziente malato alcune cellule e le ha riprogrammate in staminali. Le cellule trasformate sono sopravvissute in laboratorio e si sono divise, a differenza della maggior parte delle cellule adulte che non sopravvivono facilmente in coltura. Alle cellule, poi, è stata fatta assumere una diversa identità, come quella delle cellule maggiormente malate del paziente donatore. Un altro gruppo di ricerca, lavorando su cellule di topo, è riuscito a trasformare un tipo di cellule mature del pancreas, le esocrine, in un tipo completamente diverso: cellule beta.
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Caratteristiche:

  • Le cellule staminali sono cellule primitive non specializzate dotate della singolare capacità di trasformarsi in qualunque altro tipo di cellula del corpo.
  • Per poter essere definita come staminale una cellula deve soddisfare le seguenti proprietà:
  • autorinnovamento: capacità di compiere un numero illimitato di cicli replicativi mantenendo il medesimo stadio differenziativo
  • potenza: capacità di dare origine a una o più specie cellulari
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Ciclo vitale:

  • Sebbene le cellule staminali siano dotate di un potenziale replicativo illimitato, sono normalmente quiescenti. Infatti la parte più consistente del lavoro replicativo che porta all’incremento numerico della progenie delle cellule staminali in funzione dell’accrescimento o della riparazione dei tessuti, viene svolto da cellule non staminali definite progenitori o transit amplifying cells, derivate direttamente dalle cellule staminali, ma parzialmente differenziate e prive della capacità di autorinnovamento. Questa strategia replicativa, che limita il numero di eventi replicativi a cui una cellula staminale va incontro, si fonda su due importanti principi:
  • Stretto controllo del numero di cellule staminali: ogni cellula staminale occupa una propria nicchia biologica definita da un complesso network di segnali biochimici, che probabilmente forniscono anche alla cellula staminale le informazioni necessarie sul momento opportuno per replicarsi.
  • Conservazione dell’integrità del genoma delle cellule staminali: un basso numero di replicazioni riduce il rischio di danni al DNA, cioè di mutazioni.
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Tipi di cellule staminali:

  • In base alla potenza si possono distinguere quattro tipi di cellule staminali:
  • Una singola cellula staminale totipotente può svilupparsi in un intero organismo e persino in tessuti extra-embrionali. I blastomeri posseggono questa proprietà.
  • Le cellule staminali pluripotenti, come IPS, possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.
  • Le cellule staminali multipotenti sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.
  • Le cellule staminali unipotenti possono generare solamente un tipo di cellula specializzata.
  • Le cellule staminali si classificano anche secondo la provenienza, come adulte o embrionali:
  • Le cellule staminali adulte sono cellule non specializzate reperibili tra cellule specializzate di un tessuto specifico e sono prevalentemente multipotenti.
  • Le cellule staminali embrionali sono ottenute a mezzo di coltura, ricavate dalle cellule interne di una blastocisti.
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Cellule staminali ottenute

dal cordone ombelicale:

Il sangue residuo della placenta e del cordone ombelicale costituisce una fonte di cellule staminali emopoietiche adulte. Dal 1988 queste cellule staminali sono impiegate per curare il morbo di Gunther, la sindrome di Hunter, la sindrome di Hurler, la leucemia linfocitica acuta e molte patologie che interessano in particolare i bambini. Il sangue del cordone subisce trattamenti ed è privato dei globuli rossi prima di essere conservato in azoto liquido alla temperatura compresa tra -130° e -196° centigradi. Al momento del trapianto il sangue viene scongelato vengono filtrate le sostanze criopreservanti e somministrato al paziente per endovena. Questo genere di terapia, in cui le cellule staminali sono ottenute da un donatore estraneo, è detta allogenica. Quando le cellule sono ricavate dallo stesso paziente sul quale saranno utilizzate è detta autologa e quando provengono da individui identici, è chiamata singenica. In Italia la conservazione per uso personale è consentita solo nel caso in cui, al momento del parto, siano presenti in un neonato, nella fratria o nei genitori del neonato stesso, delle patologie che abbiano l’indicazione al trapianto con cellule staminali con sangue placentare. In questo caso si parla di donazione dedicata ed è sufficiente presentare un certificato medico degli specialisti che seguono la persona malata.

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Cellule staminali adulte:

Le cellule staminali adulte sono cellule non specializzate che si riproducono giornalmente per fornire alcune specifiche cellule.

Fino a poco tempo fa si pensava che ognuna di queste cellule potesse produrre unicamente un tipo particolare di cellula: questo processo è chiamato differenziazione. Tuttavia negli ultimi anni si sono avute prove che le cellule staminali possono acquisire molte forme differenti.

Utili fonti di cellule staminali adulte sono localizzabili in tutti gli organi del corpo.

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Cronologia della ricerca

sulle staminali:

  • 1960: Joseph Altmant e Gopal Das presentano prove di neurogenesi adulta e di attività da parte di cellule staminali nel cervello:quanto affermano contraddice il dogma di Cajal che escludeva la possibilità di formazione di nuovi neuroni.
  • 1963: McCulloch e Till illustrano la presenza di cellule staminali autorinnovanti nel midollo osseo di topo.
  • 1968: Trapianto di midollo osseo tra due fratelli tratta con successo la SCID.
  • 1978: Vengono scoperte cellule staminali ematopoietiche nel cordone ombelicale umano.
  • 1981: Vengono derivate cellule embrionali staminali di topo dalla massa cellulare interna.
  • 1992: Cellule staminali neurali sono coltivate in vitro sotto forma di neurosfere.
  • 1995: Bill Clinton firma la legge che rende illegali i fondi federali sulla ricerca di cellule staminali ottenuta dalla distruzione dell’embrione.
  • 1997: Si dimostra che la leucemia origina da cellule staminali ematopoietiche: è la prima prova diretta dell’esistenza di un nesso tra cellule staminali e cancro.
  • 1998: James Thomson e i suoi collaboratori derivano la prima linea di cellule staminali embrionali presso l’università del Wisconsin-Madison.
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2000 : Vengono pubblicati numerosi studi sulla plasticità delle cellule staminali adulte.

  • 2003: Songtao Shi del NIH scopre una nuova fonte di cellule staminali adulte nei denti da latte dei bambini.
  • 2004-2005: Hwang Woo-Suk asserisce di avere creato numerose linee di cellule staminali embrionali umani da ovociti umani non fertilizzati. Si scopre che non era vero.
  • 19 luglio 2006: George W Bush firma il veto della legge che avrebbe permesso l’uso di fondi federali per la ricerca su cellule staminali ottenute dalla distruzione dell’embrione.
  • 7 gennaio 2007: Un pool di scienziati, comprendenti l’italiano Paolo De Coppi, annuncia di aver scoperto cellule staminali nel liquido amniotico.
  • 8 aprile 2008: i fibroblasti si trasformano in cellule staminali pluripotenti, in grado di curare nei topi di laboratorio il morbo di Parkinson.
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Banche di conservazione

delle cellule staminali:

Nella maggior parte dei casi dopo il parto, il cordone ombelicale viene gettato. In alcuni

ospedali è però possibile richiedere la conservazione delle cellule staminali cordonali. Le cellule

ottenute dal cordone ombelicale sono staminali adulte il cui utilizzo non è più soggetto alle

limitazione e alle controversie etiche riguardanti le staminali embrionali. Le cellule staminali

possono essere conservate per un massimo di trent’anni immerse in celle di azoto liquido o di

vapore di azoto a -170°/-190° C. Le cosiddette “banche di conservazione delle cellule

staminali” non sono altro che laboratori in cui le unità di sangue prelevate da ciascun cordone

ombelicale vengono stoccate in capienti contenitori di azoto fino al momento del loro

eventuale utilizzo. Queste banche sono state istituite per conservare il sangue cordonale dei

neonati per cui esiste un’elevata familiarità per alcune gravi patologie (donazione dedicata) o

per conservare il sangue cordonale che alcuni genitori decidono di donare affinché, in caso di

compatibilità, possa essere trapiantato ad un bambino malato(donazione eterologa) .Nelle

banche private, l’unità di sangue prelevata dal cordone ombelicale di un bambino viene invece

conservata a suo nome (donazione autologa) e diventa a tutti gli effetti una sua proprietà; il

sangue rimane così ibernato fino al momenti in cui dovesse servire allo stesso bambino o

eventualmente a un suo familiare compatibile. In Italia esistono banche cordonali presso alcuni

istituti pubblici ma, secondo un ordinanza ministeriale del 2007, “è vietata l’istituzione di

banche per la conservazione di sangue dal cordone ombelicale presso strutture sanitarie

private” ; gli unici laboratori privati gestiti da italiani e geograficamente in territorio italiano

sono stati per questo motivo collocati nella repubblica di San Marino. Comunque la legislazione in

materia è diversa da paese a paese.

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REALIZZATO DA:

Bollati Rossella

Cibien Federica

Germano Michela

di michele lanteri valeria negro alessio santamaria

La clonazione

Di

Michele Lanteri

Valeria Negro

Alessio Santamaria

cos la clonazione
Cos’è la clonazione?

La clonazione è la riproduzione asessuata di alcuni

organismi unicellulari, di alcuni invertebrati (platelminti,

anellidi, ecc.) o di alcune piante. Il termine viene anche

utilizzato per indicare la tecnica di produzione di copie

geneticamente identiche di organismi viventi tramite

manipolazione genetica, ma l'uomo utilizza da tempo

questa tecnica anche in agricoltura con talee, margotte

e innesti. Clonare un organismo, pertanto, vuol dire creare

ex-novo un essere vivente che possiede le stesse

informazioni genetiche dell'organismo di partenza.

tecniche di clonazione
Tecniche di clonazione

Sotto il termine clonazione i mass-media hanno inserito più

cose, generando a volte, qualche perplessità oltre che

confusione. La clonazione, in senso stretto, non può essere

considerata alla stregua di un concepimento naturale in

quanto essa avviene senza un rapporto sessuale e senza

La fusione di gameti. Scientificamente parlando

Bisognerebbe definire la clonazione come un embriogenesi

asessuata, nella quale si possono distinguere tre diverse

situazioni. Queste sono: la partenogenesi, la clonazione

nucleare e la scissione embrionale.

partenogenesi
Partenogenesi

Tipo di riproduzione non sessuale in cui l’uovo si sviluppa senza essere stato fecondato dallo

spermatozoo. Si distinguono vari tipi di partenogenesi in relazione alla frequenza con cui

avviene: accidentale se si verifica in via eccezionale in specie che normalmente si riproducono

con normale fecondazione, obbligatoria quando rappresenta l’unico modo di riproduzione di

uova che non possono venire fecondate per ragioni diverse. Alcuni studi mostrano che

probabilmente gli stessi esseri umani un tempo si sarebbero riprodotti in questo modo, e la

riproduzione sessuale si sarebbe afferata solo successivamente. La partenogenesi, oltre che

ad avvenire in natura in maniera spontanea, può essere riprodotta in laboratorio, attraverso la

stimolazione chimica o elettrica della cellula uovo senza l’uso dello spermatozoo. Questa tecnica

permette di creare individui con un patrimonio genetico identico a quello di un’altra persona,

cosa che non è scontata con le altre tecniche di clonazione. Fino ad oggi gli interventi di

partenogenesi a fini riproduttivi condotti sui mammiferi non hanno avuto successo e non

hanno portato alla nascita di nuovi individui.

.

clonazione nucleare
Clonazione nucleare

Il trasferimento nucleare è una tecnica che permette di sostituire il genoma di una cellula con quello derivante da

un'altra. In termini pratici si estrae con una pipetta il nucleo da una cellula e lo si introduce dentro un oocita enucleato.

Nella clonazione nucleare il nucleo da trasferire nell’oocita può essere prelevato sia da una cellula somatica

(clonazione somatica) sia da una cellula embrionale (clonazione embrionale).

Una volta avvenuto il trasferimento, si utilizzano delle soluzione particolari in grado di stimolare l'oocita a dividersi e a

dar luogo ad un embrione, proprio come farebbe un oocita fecondato da uno spermatozoo. L'evento che ha luogo

Viene tecnicamente definito come "attivazione dell’oocita". La gravidanza viene portata avanti da una madre adottiva,

che non necessariamente appartiene alla stessa specie, ma può essere di una specie anche solo evolutivamente

vicina. La differenza tra clonazione somatica e quella embrionale, è che nel primo caso il “nascituro” riceverà il DNA

nucleare dalla persona da cui deriva la cellula somatica e il DNA mitocondriale di quella da cui deriva l’oocita, questo

significa che solo le donne possono avere figlie con il loro stesso codice genetico, dal momento che, solo loro, possono

mettere a disposizione per l’intervento di clonazione sia le cellule somatiche che gli oociti.

Per il nascituro concepito tramite la clonazione embrionale la situazione è differente, egli infatti riceverà il DNA nucleare

da un embrione e il DNA mitocondriale dalla donna che ha dato l’oocita. Evidenziare la differenza tra clonazione

embrionale e somatica è importante almeno per un primo passo verso la riflessione: nella clonazione somatica, il

nucleo trapiantato proviene da una cellula somatica appartenete ad un individuo adulto che non può non essere noto,

nella clonazione embrionale invece si parte da cellule di un embrione o feto che per forza di cose non possiamo

“conoscere” e gli individui che ne potranno derivare saranno sicuramente ignoti : conoscere come è fatto l’oggetto della

clonazione fa una grossa differenza, soprattutto se si tratta di umani. La differenza risiede nel fatto che se si parte da

un embrione si riproduce un fenomeno abbastanza naturale; se invece si parte da un individuo adulto, la componente

tecnologico scientifica diventa fortemente preponderante9 nel determinare il Dolly, ed è quella studiata e sperimentata

codice genetico del nuovo individuo. Questa tecnica del transfert nucleare è quella usata per la nascita della pecora da

Briggs, King e Gurdon10 : le sperimentazioni condotte attraverso la tecnica del trapianto dei nuclei hanno consentito

l’approfondimento di conoscenze riguardanti le prime fasi dello sviluppo di un embrione e non da ultimo è stato

possibile studiare l’importante interazione che vi è tra nucleo e citoplasma.

scissione embrionale
Scissione embrionale

La scissione embrionale è la tecnica mediante la quale si favorisce artificialmente la

scissione dell’embrione, copiando quel processo che in natura è all’origine della

nascita di gemelli monozigoti. Questa si ha nel momento in cui un ovocita

fecondato, all’inizio del suo sviluppo quando è solo una cellula, ha una particolare

divisione, per cui si formano due embrioni identici, dai quali nasceranno due

persone altrettanto identiche: i gemelli monovulari umani. Questo processo può

essere indotto artificialmente: dato che le cellule dell’embrione, per un certo tempo

sono totipotenti, cioè ognuna di esse è in grado di originare un embrione completo,

prelevando una cellula o provocando la scissione di un gruppo di cellule si può dar

vita ad un gemello dell’embrione da cui è stata prelevata la cellula. Nella pratica la suddivisione di

embrioni di mammiferi non è mai stata portata oltre la produzione di duo o tre sub-embrioni risultati

vitali dopo il loro reimpianto nell’utero di una madre surrogata.

Suddivisioni di un embrione in un numero maggiore di aggregati sub-embrionali hanno portato a

fallimenti totali. La tecnica pertanto è ancora immatura: una spiegazione sembra risedere nella limitata

disponibilità del citoplasma materno. Queste tecniche potrebbero essere applicate sia per scopi

riproduttivi che per scopi terapeutici.

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Hai mai desiderato poter avere un clone che fa i compiti per scuola mentre tu ti diverti allo skate park o esci con i tuoi amici? Immagina se potessi fare proprio quello,dove dovresti iniziare?

Che cos’è esattamente la clonazione? La clonazione è la creazione di un organismo che è l’esatta copia genetica di un’altra. Questo significa che ogni pezzo di DNA è lo stesso fra i due!

Potresti non crederci,ma ci sono cloni umani tra noi adesso. Non sono fatti in laboratorio,tuttavia;sono i gemelli identici,creati naturalmente. Sotto,vedremo come i gemelli identici naturali si collegano alle moderne tecnologie di clonazione

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Come si clona? Dovresti aver sentito parlare di clonazione per la prima volta quando la pecora Dolly entrò in scena nel 1997. Le tecnologie della clonazione erano già usate da molto prima di Dolly. Come si può fare una copia geneticamente perfetta di un organismo? Ci sono due modi per farlo:il gemellaggio embrionale artificiale e il trasferimento della cellula somatica. Come si differenziano questi processi?

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1)Gemellaggio embrionale artificiale

Il gemellaggio embrionale artificiale è una versione relativamente poco tecnologica della clonazione. Come il nome suggerisce,questa tecnologia imita il processo naturale dei gemelli identici. In natura,i gemelli si possono manifestare appena dopo la fecondazione dell’ovulo. In rari casi,quando l’uovo appena fecondato,chiamato zigote,cerca di dividersi in un embrione bi-cellulare,le due cellule si separano;ognuna continua a dividersi autonomamente,fino a che si formano individui separati all’interno della madre. Poiché le cellule provenivano dallo stesso zigote,gli individui che ne risultano sono geneticamente identici.

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Il gemellaggio embrionale artificiale usa lo stesso sistema ma si usa una capsula di Petri anziché un grembo materno. Funziona così:si separa manualmente ogni embrione precoce in cellule individuali e si consente poi ad ogni cellula di dividersi e svilupparsi separatamente. Gli embrioni che ne risultano vengono allocati in una madre surrogata che li porta a termine e li partorisce. Anche qui,poiché tutti gli embrioni provengono dallo stesso zigote,essi sono geneticamente identici.

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2)Trasferimento del contenuto nucleare

Utilizza un diverso approccio rispetto al gemellaggio embrionale artificiale ma produce lo stesso risultato:un clone perfetto o una copia genetica di un individuo. SCNT è il metodo usato per creare la pecora Dolly. Cosa significa SCNT?

Somatic cellè qualsiasi cellula del corpo eccetto i due tipi di cellule riproduttive,lo sperma e l’ovulo,che vengono anche chiamate cellule germinali. Nei mammiferi ogni cellula somatica ha due filamenti completi di cromosoma mentre le cellule germinali ne hanno solo uno completo.

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Nuclear Il nucleo è come il cervello di una cellula e ne è la parte che contiene tutte le informazioni utili a formare un organismo. Queste informazioni si costituiscono nella forma del DNA e sono queste differenze nel DNA che ci rendono unici.

Transfer = Spostare un oggetto da un posto all’altro.

Per creare Dolly i ricercatori hanno isolato una cellula somatica da una pecora femmina adulta. Poi hanno trasferito il nucleo da quella cellula ad un ovocita da cui era stato eliminato il nucleo.dopo un paio di leggere modifiche a livello molecolare,l’ovocita,con il nuovo nucleo si comportava proprio come uno zigote appena fecondato;si è sviluppato in un embrione che venne impiantato in una madre surrogata e portata a termine. L’agnello era la replica genetica esatta della pecora femmina adulta che aveva donato il nucleo all’ovocita. Dolly fu il primo mammifero ad essere stato clonato da una cellula somatica adulta.

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Come il SCNT si differenzia dal modo naturale nel creare un embrione?La fecondazione di un uovo ad opera dello sperma e il metodo di clonazione SCNT ottengono lo stesso risultato:un insieme di cellule che si dividono chiamato embrione. Quindi qual è la differenza tra questi due metodi?

Un embrione è composto da cellule che contengono il DNA completo. La differenza tra la fecondazione e il metodo SCNT è da dove hanno origine i due sets di cromosomi.

Infatti l’unione tra sperma e ovulo da origine a uno zigote con due sets :uno dal padre(sperma) e uno dalla madre(ovulo)ed è così geneticamente unico, mentre l’embrione che risulta al termine del processo SCNT possiede entrambi i sets di cromosomi che provengono da una sola cellula somatica ed è così geneticamente identico.

cos la terapia genetica
Cos’è la terapia genetica

Immagina di rompere accidentalmente la finestra del vicino.cosa dovresti fare?potresti:

  • 1 stare in silenzio;nessuno saprà che sei tu il colpevole,ma la finestra non verrà riparata
  • 2 cerchi di riparare la finestra rotta con un po’ di scotch;non è la soluzione migliore a lungo termine
  • 3 metti una nuova finestra;non solo risolvi il problema,ma fai anche la cosa prestigiosa

Ma che cosa centra con la terapia genetica?

Puoi pensare a una condizione genetica o malattia a una “finestra rotta”. Molte condizioni mediche risultano da difetti o mutazioni,in una o più dai geni di una persona. Le mutazioni causano la decomposizione di una base azotata e porta alla malfunzione di quel gene.

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Quando una proteina funziona male,le cellule che dipendono da quella proteina non si comportano normalmente,causando problemi a tutti i tessuti e organi. Le condizioni mediche riferite alle mutazioni del gene sono chiamate disordini genetici.

Quindi,se un gene difettoso causa la nostra “finestra rotta”,puoi “ripararla”? Quali opzioni hai a disposizione?

  • 1 stai in silenzio;ignori il disordine genetico e non ripari nulla
  • 2 provi a trattare il disordine con farmaci o altri approcci;dipende dal disordine,il trattamento potrebbe o no essere una soluzione a lungo termine
  • 3 ne metti uno normale,copiando il gene funzionante;se puoi farlo,potrebbe risolvere il problema

Se ha successo,la terapia genetica fornisce una via per risolvere un problema fino alla fonte. Aggiungendo una corretta copia al gene potrebbe aiutare le cellule,tessuti e organi danneggiati a lavorare correttamente. La terapia genetica si differenzia dagli approcci basati sui farmaci,che potrebbero trattare il problema,ma non riparare la malattia genetica fondamentale.

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Ma la terapia genetica non è una soluzione semplice – non ripara immediatamente l’errore genetico. Comunque gli scienziati e i fisici stanno facendo progressi nella ricerca della terapia genetica,e hanno molto più lavoro da fare per poter ottenere il pieno potenziale.

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La terapia genetica potrebbe potenzialmente trattare di sicuro i disordini alla fonte riparando i difetti genetici interessati. Molti disordini o condizioni mediche potrebbero essere trattati con la terapia genetica,ma altre potrebbero non essere adatti con lo stesso approccio.

Come si sa che un disordine è un buon candidato alla terapia genetica?

per il disturbo candidato devi rispondere alle seguenti domande
Per il disturbo candidato,devi rispondere alle seguenti domande

1) La condizione risulta da una mutazione di uno o più geni? Anche per te che considera la terapia genetica,la risposta deve essere sì

2) Quali geni sono complessi? Se pianifichi di trattare un difetto genetico,hai bisogno di sapere quale gene(i) seguire. Devi anche avere una copia di DNA del gene disponibile nel tuo laboratorio. I migliori candidati alla terapia genetica sono chiamati disordini “singolo gene”-che sono causati da mutazioni di un solo gene.

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Cosa si sa sulla biologia del disordine? Designare il migliore approccio possibile,cercare di imparare tutto il possibile riguardo ai fattori genetici nel disordine. Per esempio:

  • Quali tessuti sono affetti?
  • Quale ruolo fa il gene codificato con le cellule del tessuto?
  • Esattamente come le mutazioni colpiscono la funzione della proteina?
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4) Aggiungendo una normale copia del gene risolverà il problema del tessuto affetto? Questa può sembrare come una domanda ovvia,ma non lo è. Che cosa succede se un gene mutato codifica una proteina e impedisce alla normale proteina dal fare il suo lavoro? I geni mutati con la funzione come questa sono chiamati dominanti negativi,e rimettendo la proteina normale potrebbe non risolvere il problema.

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5) Puoi consegnare il gene ai tessuti affetti? La risposta arriverà dalle varie fonti di informazioni,includendo:

  • Quanto è accessibile il tessuto? Se è più facile da raggiungere(pelle,sangue,polmoni)o più difficile(organi interni)
  • Qual è il miglior metodo di trasporto? Puoi trovare i pro e i contro dei potenziali metodi di trasporto nel “Gli attrezzi del mestiere”

Se rispondi “sì” alle domande 4 e 5,allora il disturbo potrebbe essere un buon candidato per la terapia genetica

chlamydia tracomatis
Chlamydia Tracomatis

La Chlamydia Tracomatis(Ct) è una delle malattie più comuni trasmesse sessualmente. I sintomi sono rappresentati da cervicite,infiammazione e dolore alla zona pelvica nella donna,uretrite ed epididimite nell’uomo. Le infezioni da Ct possono essere dimostrate da un aumento significativo degli anticorpi o dalla rivelazione del microrganismo nelle secrezioni infette. I metodi di diagnosi del microrganismo sono:

  • Coltura del microrganismo
  • Immunofluorescenza diretta
  • Determinazione antigenica in ELISA
  • Amplificazione genica
micobacterium tubercolosis
Micobacterium Tubercolosis

Dopo un progressivo declino dell’endemia tubercolare,la tubercolosi ha ripreso a manifestarsi in alcuni gruppi dove la riduzione delle difese immunitarie facilita la comparsa di forme cliniche molto gravi. Test tubercolinico,anamnesi,esame semiologico e radiologico sono gli elementi che contribuiscono a formulare il sospetto o la probabilità diagnostica di tubercolosi,senza avere la certezza assoluta. Con le colture batteriologiche invece si ha certezza di malattia. Le tecniche di amplificazione( PCR o LCR)permettono in tempi rapidi di ottenere risultati specifici e sensibili. Dal campione biologico dopo la concentrazione,decontaminazione e digestione,viene estratto il DNA del Micobacterium Tubercolosis complex.

helicobacter pylori
Helicobacter Pylori

L’infezione da Helicobacter Pylori(HP), rappresenta uno dei fattori alla gastrite cronica ed è associabile alla maggior parte dei casi dell’ulcera gastrica e duodenale. Inoltre,è stato riconosciuto il ruolo carcinogeno nella patogenesi di carcinomi e linfomi gastrici. L’infezione acuta da HP delle mucose gastriche è associata a una sintomatologia aspecifica(dolori epigastrici,nausea e vomito contenente muco)che scompare entro 1-2 settimane,ma l’infezione sfocia in una fase cronica,non sempre associata a sintomatologia addominale. Con la PCR è possibile identificare l’agente patogeno non solo in prelievi bioptici dallo stomaco e nelle secrezioni gastriche,ma anche dalla saliva e in campioni fecali;dopo l’estrazione del DNA,un frammento del gene viene amplificato con primers specifici che permettono di distinguere,in caso di positività,il ceppo con importanti implicazioni prognostiche.

citomegalovirus
Citomegalovirus

Le infezioni da citomegalovirus(CMV) sono molto diffuse e può causare epatite,polmonite o un a malattia simile alla mononucleosi;se acquisita in utero o alla nascita,comporta anormalità congenite,compresa epatosplenomegalia,deficienza e ritardo mentale. L’infezione del CMV è frequente in pazienti immunocompromessi come quelli affetti da AIDS o da tumori;una importante fonte di contagio per gli immunocompromessi è rappresentata dalle trasfusioni. Studi retrospettivi hanno dimostrato che con la tecnica di amplificazione genica è possibile determinare il CMV nei pazienti affetti da AIDS,con elevata sensibilità e specificità. Più recenti studi prospettici hanno enfatizzato il ruolo della PCR nel rilevare il virus nel liquor prima della comparsa di evidenze istopatologiche di malattia intracerebrale.

virus di epstein barr
Virus di Epstein-Barr

L’infezione da EBV è spesso asintomatica e negli adolescenti si manifesta spesso come mononucleosi infettiva,malattia linfoproliferativa acuta benigna e autolimitante,caraterizzata da astenia,febbre,angina,adeno e splenomegalia;come per gli altri virus erpetici,può causare un infezione latente persistente con possibilità di riattivazione. Per la diagnosi può essere impiegata la sierologia specifica,che permette di differenziare le infezioni da EBV da malattie con sintomatologia simile. La determinazione del DNA virale può essere eseguita,dopo estrazione dal campione biologico,mediante amplificazione con primers specifici o anche con metodi di ibridazione in situ su substrato cellulare.

parvovirus b19
Parvovirus B19

Le infezioni da Parvovirus(PV)sono molto frequenti;le manifestazioni più comuni sono l’eritema infettivo,caratterizzata da esantema(megaloeritema epidemico),tumefazioni linfonodali,sintomi influenzali e poliartralgia o poliartrite. Il virus ha un accentuato tropismo per i precursori eritrocitari e può provocare compromissioni della funzionalità degli organi emopoietici. Nella maggioranza delle situazioni cliniche la diagnosi di laboratorio di una infezione da PV si basa su dati sierologici. In alcune situazioni,dovute a una risposta immunitaria soppressa o ritardata,i livelli anticorpali possono non essere un mezzo sicuro per una diagnosi per infezione;in queste situazioni il miglior mezzo diagnostico è rappresentato dall’amplificazione mediante PCR;il DNA virale viene estratto dal campione e viene amplificata una regione di un gene che codifica per una proteina strutturale del virus (VP1).

slide106

Laboratorio

di

Inglese

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DNA extraction is a routine procedure to collect DNA for subsequent

molecular or forensic analysis. There are three basic steps in a DNA

extraction:

  • Breaking the cells open, commonly referred to as cell disruption, to expose the DNA within, such as by grinding or sonicating the sample.
  • Removing membrane lipids by adding a detergent.
  • Precipitating the DNA with an alcohol — usually ethanol or isopropanol. Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation. This step also removes alcohol-soluble salt.

Refinements of the technique include adding a chelating agent to

sequester divalent cations such as Mg2+ and Ca2+. This stops dnase

enzymes from degrading the DNA.

Cellular and histone proteins bound to the DNA can be removed prior

to its precipitation either by adding a protease or having prior to

precipitation, precipitating with sodium or ammonium acetate, or

extracting with a phenol-chloroform mixture.

If desired, the DNA can be resolubilized in a slightly alkaline buffer.

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DNA

In this experiment you need to isolate some dna from a

human test subject. Why,You may ask,do you need human

dna? Scientists isolate dna for a variety of reasons, some

of which include:

  • genetic testing
  • body identification
  • analysis of forensic evidence
dna extraction
DNA extraction

DNA extraction is tipically the first step in a longer laboratory process.

DNA extraction is an important of that process because the dna first needs to be purified away from proteins and other cellular contaminants.

We need cells because that is where the dna is. Inside almost every cell in our bodies is a nucleus, and inside each nucleus is about two meters of dna.

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Where do we begin?

First we need to collect some cells from our test subject.

The skin on the inside of our mouthes loses thousands of cells every day.These are the cells we’re after.

Let’s get started

The steps you will follow to purify DNA from cheek swab are shown below.

  • Collect cheek cells
  • Burst cells open to release DNA.
  • Separate DNA from proteins and debris.
  • Isolate concentrated DNA.
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Detecting DNAMain article: Quantification of nucleic acidsA diphenylamine (DPA) indicators will confirm the presence of DNA. This procedure involves chemical hydrolysis of DNA: when heated (e.g. ≥95oC) in acid, the reaction requires a deoxyribose sugar and therefore is specific for DNA. Under these conditions, the 2-deoxyribose is converted to w-hydroxylevulinyl aldehyde, which reacts with the compound, diphenylamine, to produce a blue-colored compound. DNA concentration can be determined measuring the intensity of absorbance of the solution at the 600 nm with a spectrophotometer and comparing to a standard curve of known DNA concentrations.Measuring the intensity of absorbance of the DNA solution at wavelengths 260 nm and 280nm is used as a measure of DNA purity. DNA absorbs UV light at 260 and 280 nm, and aromatic proteins absorbs UV light at 280 nm; a pure sample of DNA has the 260/280 ratio at 1.8 and is relatively free from protein contamination. A DNA preparation that is contaminated with protein will have a 260/280 ratio lower than 1.8.DNA can be quantified by cutting the DNA with a restriction enzyme, running it on an agarose gel, staining with ethidium bromide or a different stain and comparing the intensity of the DNA with a DNA marker of known concentration.

gel electrophoresis

Gel electrophoresis

Have you ever wondered how scientists work with tiny molecules that they can't see? Here's your chance to try it yourself! Sort and measure DNA strands by running your own gel electrophoresis experiment.

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You are holding a small splastic tube with some clear liquid in it. You’ve been told that the liquid contains DNA strands of several different lenghts. Your job is to figure out what those lenghs are. How will you do it?
  • DNA STRANDS: if the DNA strands were as big as your shoe laces, you could sort them by hand into groups and measure them
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But DNA strands are molecules so tiny that you can’t see them even under most microscopes. Is there a wat to sort and measure the DNA strands in your tube even though you can’t see or touch them? There is! It’s called gel lectrophoresis ( pronunced ee-LEK-tro-fo-REE-sis)
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Scientists use gel electrophoresis whenever thet need to sort DNA strands according to lenghts. This technique is also useful for separatin other types of molecules, like proteins. How does this work? The “gel” is the filtrer that sort the DNA strands. It’s like a spange made of jell-o with many small holes in it. We place DNA sample into holes at one end of the gel.
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“Electrophoresis” is how we push the DNA strands through the gel filter. By adding an electrical current, we can make the DNA move. Short strands move through the holes in the gel more quickly than long strands. Over time, the shorter strands in the sample will move farther away from the starting point than the longer strands. DNA strands og the same lenght will move at the same speed and end up grouped together. In this way, the DNA strands in the sample sort themselves.

  • Staining the sorted group of DNA makes them visible to the naked eye. Although we can’t see a single DNA strand, we can see large groups of stained DNA strands. These groups show up as bands in the gel. now. It’s your turn to “run a gel” (that’s scientist slang for gel electrophosis. Follow along with the STEPS shown above!
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Here is what you will need to make a gel:
  • Powered agarose, buffer, a flask, a microwave, the gel mold and the gel comb. Making an electropharesis gel is a lot like making Jell-O. But you don’t want to eat this type of gel!