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遺傳工程（ genetic engineering ）

遺傳工程（ genetic engineering ）. 大綱 遺傳工程技術 限制酶 載體 選殖基因的確認 基因庫的製作 遺傳工程技術的應用範圍. 遺傳工程技術（ DNA 重組技術）所需材料. 限制 酶 ( restriction enzyme) + 接合 酶 (ligase) + 載體 (vector) ↓ 轉形 (transformation) 至 細菌 中 DNA 選殖 - 基因選殖 (DNA cloning- gene cloning). 載體 攜帶基因進入細菌體的物質 可在細菌複製與繁殖

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遺傳工程（ genetic engineering ）

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Presentation Transcript

  1. 遺傳工程（genetic engineering） • 大綱 • 遺傳工程技術 • 限制酶 • 載體 • 選殖基因的確認 • 基因庫的製作 • 遺傳工程技術的應用範圍

  2. 遺傳工程技術（DNA重組技術）所需材料 限制酶(restriction enzyme) + 接合酶(ligase) + 載體(vector) ↓ 轉形(transformation)至細菌中 DNA選殖-基因選殖 (DNA cloning- gene cloning)

  3. 載體 • 攜帶基因進入細菌體的物質 • 可在細菌複製與繁殖 • 細菌的質體(plasmid)與噬菌體(bacteriophage) • 宿主生物 • 最常用為細菌 • 因細菌的質體易從細胞中分離，也容易進入細胞 • 生長快速 • 缺點：與真核生物轉錄與轉譯有些差別 • 後轉譯修飾-加上醣基或脂質

  4. 限制酶restriction enzyme • 原核生物所產生 • 保護原核生物免於外來DNA感染 • 1970 Johns Hopkins Hamiton Smith所分離 • 辨識DNA上特定的核苷酸序列 • 雙股DNA 4-8個核苷酸 • 雙股序列相同，方向相反， 稱迴文序列palindromic sequence • 命名法：Hind III（Haemophilus infuenzae） • 第一個字母細菌的屬名genus • 第二、三字母細菌的種名species • 第四個字母細菌的strain • 羅馬數字為發現的順序

  5. 限制酶因切割位置不一樣有三種缺口 • 切出5’端突出的黏端5’-cohesive (sticky end) • 切出3’端突出的黏端3’-cohesive (Sac I) • 切出鈍端blunt-end

  6. 質體(Plasmid) • 復製原ori：才能在細菌中大量複製 • 耐抗生素基因：以利選殖出帶有此質體的細菌株 • 選殖位置(mutiple cloning sites)供選殖基因接入的位置。

  7. 相同複製原的質體屬世同個不親和群體(incompatibility group) • 當細菌中 已經先有了某種質體，種製原和它相同的質體就不能再進入 • 複製 原來源不同的質體，可以同時存在同一個細菌中

  8. 勝任細胞competent cells • 進行基因選殖時，不可能 利用自然發生的接合現象來完成細菌轉型的步驟 • 改變細菌的細胞壁，增加細胞膜的通透性，讓質體很容易進入，這種細胞稱為勝任細胞(competent cell) • CaCl2化學處理 • 便宜簡單的常用方法，並不因為方法老舊而被淘汰 • 電穿孔(electroporation) 方式 • 瞬間電流打洞提高細菌吃入DNA能力

  9. 細菌品系的選擇 • 製作勝任細胞必須要選用正處生長 旺盛期的健康細菌 • 現在大量被用來作實驗的細菌大部分是大腸桿菌，僅品系不一樣strain • 防止細菌發生基因重組或突變

  10. DNA重組成功的篩選方法-菌落藍白篩選 • 確認載體成功進入細菌 • 使用抗生素標記 • 確認基因有接入載體 • lacZ基因被插壞

  11. 乳糖操作組 半乳糖苷酶 滲入酶 乙醯基轉化酶 無作用之 抑制劑 誘導物 (Klein et al.2003)

  12. 確定DNA重組成功的方法 • LacZ基因可產生半乳糖苷酶，分解X-gal生成藍色菌落 • LacZ基因被外來DNA插壞，不產生半乳糖苷酶，無法分解X-gal，菌落呈白色

  13. 半乳糖苷酶 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside )

  14. 基因庫的建立與篩選 原核生物：染色體DNA 真核生物： mRNA ↓ cDNA ↓ 質體株(plasmid clones) ↓ 基因體庫(genomic library) ↓ 專一性 分子探針(molecular probe)

  15. mRNA的純化步驟

  16. cDNA製作

  17. 遺傳工程在植物轉殖的應用 • 組織培養 • 將植物體的部分細胞、組織、器官等在無菌狀態下從母體分離，使之成為一株新植物 • 應用於種苗繁殖與育種 • 無菌播種、無病毒健康植物苗、原生質體體細胞雜交、建立種原基因庫 • 基因轉殖植物 • 將外來DNA殖入植物體內，使植物體表現外來基因的功能 • 應用於農作物、花卉

  18. 進行植物基因轉殖常用的方法 • 植物細菌載體法 • 農桿菌(Agrobacterium, G-) 中的根瘤農桿菌(感染雙子葉植物) • 植物在莖部或傷口會產生冠癭腫瘤 • Ti質體(tumor-in ducing plasmid)之 T DNA可嵌物植物基因體中 • 冠癭鹼合成酶誘發冠癭腫瘤產生

  19. Ti質體圖譜 參考資料：http://www.bios.net/daisy/AgroTran/1051/version/default/part/ImageData/data

  20. 植物基因轉殖流程圖

  21. 轉基因作物培養方式 資料來源： www.dyu.edu.tw

  22. 基因轉殖植物的應用 • 主要轉殖於經濟作物：大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、煙草、馬鈴薯、水稻…… • 抗蟲基因-蘇力菌(Bacillus thyringiensis) 殺蟲結晶蛋白質基因(Bt基因) • 蘇力菌孢子被昆蟲食用，於腸道中釋放出殺蟲結晶蛋白質，轉化成毒素破壞使腸細胞，蟲子因無法進食而死亡 • 抗病基因: • 抗病毒：弱病毒(外殼蛋白coat protein, CP) • 細菌：活化溶菌酶基因 • 真菌：增加幾丁質和葡聚糖水解酶表現

  23. 轉Bt基因作物 實驗組 對照組 資料來源http://www.agbioforum.org

  24. 轉基因木瓜一 對照組 實驗組 資料來源http://www.agbioforum.org

  25. 轉基因木瓜二 對照組 實驗組 資料來源http://www.agbioforum.org

  26. 抗逆境基因 • 抗旱: 調節滲透壓蛋白質 • 高鹽: 調節滲透壓蛋白質 • 溫度: 抗凍基因(降低冰點、減緩冰晶生成速度) • 提高農作物產量與質量基因 • C4導入C3 提高光合作用效率 • 質量: 降低膽固醇、防止動脈硬化 不飽合脂肪酸-鏈長度 • 黃金米 • 轉殖胡蘿蔔素基因到稻米中 • 高鐵質米 • 甜甜米-澱粉與蛋白質含量較高

  27. 黃金米 含胡蘿蔔素 一般白米 富含鐵質 資料來源http://www.agbioforum.org

  28. 生長更快速的基因 • 阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana) • 基因體小，模式植物 • 促進細胞分裂之基因 • 轉殖於煙草中

  29. 抗殺草劑基因 • 雜草 VS 農作物 • 抑制植物代謝 • 轉殖細菌的抗殺草劑基因 • 基因轉殖植物可能衍生的問題 • 品種單純化 • 威脅其他農作物生長 • 影響遺傳的多樣性 • 改變植物生態 • 抗藥基因的轉移

  30. 基因轉殖動物的運用 • 基礎醫學研究：模式動物 • 提高動物產值：提高肉質、減少脂肪 • 增進動物健康：提升動物的免疫力 • 提供人類器官移植來源：轉基因豬、羊 • 改變乳汁成分：乳鐵蛋白、溶菌酶、減少乳糖含量 • 基因工程藥物：透過乳線分泌 • 動物分子農場 • 基因轉殖動物的管理

  31. 動物複製技術 • Clone 複製是指無性生殖 • 不同於有性生殖 • 無基因重組 • 基因型完全相同 • 表現型（不）完全相同 • 複製動物的種類 • 複製羊（桃莉Dolly, 1996年） • 複製牛、豬、老鼠、狗 • 複製寵物

  32. 複製羊流程 (影片: dolly.mpg) (張玉瓏等, 2006)

  33. 複製羊桃莉與其父母

  34. 台灣的複製牛 I • 2001年-畜寶（僅存活6天） 資料來源：農委會

  35. 台灣的複製牛 II • 2003年-如意家族（牛耳細胞） 資料來源：農委會

  36. 台灣的雙基因轉殖複製豬 • 2002年-酷比家族 • 含乳鐵蛋白和人類第九凝血因子 資料來源：農委會

  37. 抗排斥基因轉殖豬 • 含人類HLA-II與hDAF兩系列基因 • 進一步剔除豬抗原表現基因 • 提供器官移植來源

  38. 台灣的複製羊 • 2002年-寶吉、寶祥 資料來源：農委會

  39. 2004年：含人類第八凝血因子

  40. 台灣螢光豬 • 2006、2007誕生，細胞有螢光，移植到其他部位，就容易辨別，到底是新生組織，還是自體組織分化所生成的。 資料來源：台灣大學

  41. 複製人 • 科學問題? 成功率很低 • 倫理道德? 全世界政府都反對生殖複製 • 複製技術所遭遇的問題 • 成功率低：從不到1％進展到5％以上 • 存活率：畸形、免疫力低、未老先衰 • 早衰與染色體的端粒有關 • 端粒的煩惱? • 複製次數增加端粒逐漸縮短

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