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遺傳工程( genetic engineering ). 大綱 遺傳工程技術 限制酶 載體 選殖基因的確認 基因庫的製作 遺傳工程技術的應用範圍. 遺傳工程技術( DNA 重組技術)所需材料. 限制 酶 ( restriction enzyme) + 接合 酶 (ligase) + 載體 (vector) ↓ 轉形 (transformation) 至 細菌 中 DNA 選殖 - 基因選殖 (DNA cloning- gene cloning). 載體 攜帶基因進入細菌體的物質 可在細菌複製與繁殖

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genetic engineering
遺傳工程(genetic engineering)
  • 大綱
    • 遺傳工程技術
    • 限制酶
    • 載體
    • 選殖基因的確認
    • 基因庫的製作
    • 遺傳工程技術的應用範圍
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遺傳工程技術(DNA重組技術)所需材料

限制酶(restriction enzyme)

+

接合酶(ligase)

+

載體(vector)

轉形(transformation)至細菌中

DNA選殖-基因選殖 (DNA cloning- gene cloning)

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載體

    • 攜帶基因進入細菌體的物質
    • 可在細菌複製與繁殖
    • 細菌的質體(plasmid)與噬菌體(bacteriophage)
  • 宿主生物
    • 最常用為細菌
    • 因細菌的質體易從細胞中分離,也容易進入細胞
    • 生長快速
    • 缺點:與真核生物轉錄與轉譯有些差別
      • 後轉譯修飾-加上醣基或脂質
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限制酶restriction enzyme
    • 原核生物所產生
    • 保護原核生物免於外來DNA感染
    • 1970 Johns Hopkins Hamiton Smith所分離
    • 辨識DNA上特定的核苷酸序列
    • 雙股DNA 4-8個核苷酸
    • 雙股序列相同,方向相反, 稱迴文序列palindromic sequence
    • 命名法:Hind III(Haemophilus infuenzae)
      • 第一個字母細菌的屬名genus
      • 第二、三字母細菌的種名species
      • 第四個字母細菌的strain
      • 羅馬數字為發現的順序
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限制酶因切割位置不一樣有三種缺口
    • 切出5’端突出的黏端5’-cohesive (sticky end)
    • 切出3’端突出的黏端3’-cohesive (Sac I)
    • 切出鈍端blunt-end
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質體(Plasmid)
    • 復製原ori:才能在細菌中大量複製
    • 耐抗生素基因:以利選殖出帶有此質體的細菌株
    • 選殖位置(mutiple cloning sites)供選殖基因接入的位置。
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相同複製原的質體屬世同個不親和群體(incompatibility group)
  • 當細菌中 已經先有了某種質體,種製原和它相同的質體就不能再進入
  • 複製 原來源不同的質體,可以同時存在同一個細菌中
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勝任細胞competent cells
    • 進行基因選殖時,不可能 利用自然發生的接合現象來完成細菌轉型的步驟
    • 改變細菌的細胞壁,增加細胞膜的通透性,讓質體很容易進入,這種細胞稱為勝任細胞(competent cell)
    • CaCl2化學處理
      • 便宜簡單的常用方法,並不因為方法老舊而被淘汰
    • 電穿孔(electroporation) 方式
      • 瞬間電流打洞提高細菌吃入DNA能力
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細菌品系的選擇
    • 製作勝任細胞必須要選用正處生長 旺盛期的健康細菌
    • 現在大量被用來作實驗的細菌大部分是大腸桿菌,僅品系不一樣strain
    • 防止細菌發生基因重組或突變
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DNA重組成功的篩選方法-菌落藍白篩選
  • 確認載體成功進入細菌
    • 使用抗生素標記
  • 確認基因有接入載體
    • lacZ基因被插壞
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乳糖操作組

半乳糖苷酶 滲入酶 乙醯基轉化酶

無作用之

抑制劑

誘導物

(Klein et al.2003)

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確定DNA重組成功的方法
  • LacZ基因可產生半乳糖苷酶,分解X-gal生成藍色菌落
  • LacZ基因被外來DNA插壞,不產生半乳糖苷酶,無法分解X-gal,菌落呈白色
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半乳糖苷酶

X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside )

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基因庫的建立與篩選

原核生物:染色體DNA

真核生物:

mRNA

cDNA

質體株(plasmid clones)

基因體庫(genomic library)

專一性 分子探針(molecular probe)

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遺傳工程在植物轉殖的應用

    • 組織培養
      • 將植物體的部分細胞、組織、器官等在無菌狀態下從母體分離,使之成為一株新植物
      • 應用於種苗繁殖與育種
        • 無菌播種、無病毒健康植物苗、原生質體體細胞雜交、建立種原基因庫
    • 基因轉殖植物
      • 將外來DNA殖入植物體內,使植物體表現外來基因的功能
      • 應用於農作物、花卉
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進行植物基因轉殖常用的方法
    • 植物細菌載體法
      • 農桿菌(Agrobacterium, G-) 中的根瘤農桿菌(感染雙子葉植物)
      • 植物在莖部或傷口會產生冠癭腫瘤
        • Ti質體(tumor-in ducing plasmid)之 T DNA可嵌物植物基因體中
        • 冠癭鹼合成酶誘發冠癭腫瘤產生
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Ti質體圖譜

參考資料:http://www.bios.net/daisy/AgroTran/1051/version/default/part/ImageData/data

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轉基因作物培養方式

資料來源: www.dyu.edu.tw

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基因轉殖植物的應用
  • 主要轉殖於經濟作物:大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、煙草、馬鈴薯、水稻……
  • 抗蟲基因-蘇力菌(Bacillus thyringiensis)

殺蟲結晶蛋白質基因(Bt基因)

    • 蘇力菌孢子被昆蟲食用,於腸道中釋放出殺蟲結晶蛋白質,轉化成毒素破壞使腸細胞,蟲子因無法進食而死亡
  • 抗病基因:
    • 抗病毒:弱病毒(外殼蛋白coat protein, CP)
    • 細菌:活化溶菌酶基因
    • 真菌:增加幾丁質和葡聚糖水解酶表現
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轉Bt基因作物

實驗組

對照組

資料來源http://www.agbioforum.org

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轉基因木瓜一

對照組

實驗組

資料來源http://www.agbioforum.org

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轉基因木瓜二

對照組

實驗組

資料來源http://www.agbioforum.org

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抗逆境基因
    • 抗旱: 調節滲透壓蛋白質
    • 高鹽: 調節滲透壓蛋白質
    • 溫度: 抗凍基因(降低冰點、減緩冰晶生成速度)
  • 提高農作物產量與質量基因
    • C4導入C3 提高光合作用效率
    • 質量: 降低膽固醇、防止動脈硬化

不飽合脂肪酸-鏈長度

    • 黃金米
      • 轉殖胡蘿蔔素基因到稻米中
      • 高鐵質米
      • 甜甜米-澱粉與蛋白質含量較高
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黃金米

含胡蘿蔔素

一般白米

富含鐵質

資料來源http://www.agbioforum.org

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生長更快速的基因
  • 阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)
    • 基因體小,模式植物
    • 促進細胞分裂之基因
    • 轉殖於煙草中
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抗殺草劑基因
    • 雜草 VS 農作物
    • 抑制植物代謝
    • 轉殖細菌的抗殺草劑基因
  • 基因轉殖植物可能衍生的問題
    • 品種單純化
    • 威脅其他農作物生長
    • 影響遺傳的多樣性
    • 改變植物生態
    • 抗藥基因的轉移
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基因轉殖動物的運用
    • 基礎醫學研究:模式動物
    • 提高動物產值:提高肉質、減少脂肪
    • 增進動物健康:提升動物的免疫力
    • 提供人類器官移植來源:轉基因豬、羊
    • 改變乳汁成分:乳鐵蛋白、溶菌酶、減少乳糖含量
    • 基因工程藥物:透過乳線分泌
  • 動物分子農場
  • 基因轉殖動物的管理
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動物複製技術
  • Clone 複製是指無性生殖
  • 不同於有性生殖
    • 無基因重組
    • 基因型完全相同
    • 表現型(不)完全相同
  • 複製動物的種類
    • 複製羊(桃莉Dolly, 1996年)
    • 複製牛、豬、老鼠、狗
    • 複製寵物
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複製羊流程

(影片: dolly.mpg)

(張玉瓏等, 2006)

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台灣的複製牛 I

  • 2001年-畜寶(僅存活6天)

資料來源:農委會

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台灣的複製牛 II
  • 2003年-如意家族(牛耳細胞)

資料來源:農委會

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台灣的雙基因轉殖複製豬
  • 2002年-酷比家族
  • 含乳鐵蛋白和人類第九凝血因子

資料來源:農委會

slide45
抗排斥基因轉殖豬
  • 含人類HLA-II與hDAF兩系列基因
  • 進一步剔除豬抗原表現基因
  • 提供器官移植來源
slide46
台灣的複製羊
  • 2002年-寶吉、寶祥

資料來源:農委會

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台灣螢光豬
  • 2006、2007誕生,細胞有螢光,移植到其他部位,就容易辨別,到底是新生組織,還是自體組織分化所生成的。

資料來源:台灣大學

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複製人
    • 科學問題? 成功率很低
    • 倫理道德? 全世界政府都反對生殖複製
  • 複製技術所遭遇的問題
    • 成功率低:從不到1%進展到5%以上
    • 存活率:畸形、免疫力低、未老先衰
    • 早衰與染色體的端粒有關
      • 端粒的煩惱?
      • 複製次數增加端粒逐漸縮短
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幹細胞
  • 定義:一群尚未分化的細胞,可分化成特定組織
    • 全能幹細胞:每個細胞均可發育成一完整生物體
    • 多能幹細胞:可發育成特定組織如:血液幹細胞、神經幹細胞、皮膚幹細胞
  • 來源:
    • 人類胚胎囊胚期的內細胞質團,稱人類胚胎幹細胞
    • 胎兒的生殖組織培養(經捐贈者同意)
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複製的相關進展
  • 複製技術
    • 體細胞的細胞核經由體細胞核轉殖到卵母細胞而產生的囊胚
      • 可發育出活的個體
      • 可培養成胚胎幹細胞
    • 暗示了卵母細胞的細胞質可能含有一些因子可以將轉殖後的體細胞核重新導引到具有多能性的狀態
      • 2006年日本京都大學山中伸彌(Shinya Yamanaka) 教授將四種基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4轉殖到老鼠已經分化的纖維母細胞
      • 已分化的纖維組織母細胞重新設定變回幹細胞
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基因治療的應用範圍
  • 癌症治療
    • 使用免疫調控基因:細胞激素基因送入癌細胞→癌症疫苗→疫苗打入動物體→誘發宿主的免疫系統辨識癌細胞
    • 送入自殺基因-配合藥物作用
    • 引入抑癌或細胞凋亡基因使用抗血管生成因子:利用反義(anti-sense)RNA
  • 感染性疾病治療
    • 送入感染處抑制病原菌基因表現
  • 遺傳疾病治療
    • 技術限制-單一基因疾病
  • 心臟血管疾病治療
    • 利用某些自殺基因消除增生的血管細胞
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當雙股RNA進入 細胞之後,會被Dicer切成21-23個核苗酸的小片段,稱作 siRNA(small interference RNA)。然後這些小小的RNA片段會再與 相對應的mRNA配對,讓RNA因此分解,以達到阻止基因表現的目的

RNA干擾技術原理(ds RNA-Mediated Interference 簡稱RNAi)

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組織工程
  • 將特殊細胞培植在骨架上,重建特定的組織或器官。最早產品人工皮膚
  • 主要市場:整形外科、傷口療護、心血管疾病
  • 優點:
    • 用少量組織體外增殖
    • 量身訂做器官原貌
    • 易克服排斥問題
  • 現況與未來
    • 軟骨、血管、皮膚、神經組織……..人造手
    • 結合基因工程和幹細胞技術
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組織工程的要素
  • 細胞
    • 自體細胞、同種細胞、異種細胞、幹細胞、基因改造細胞
  • 人工細胞外間質
    • 可分解天然或合成高分子材料
    • 多孔性結構
    • 膠原蛋白、藻膠酸、幾丁質
    • 合成聚合物-聚乳酸
  • 生長訊息
    • 需有傳達細胞貼附、增生、遷徙、分化的各種訊息因子