Genetica funcional
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GENETICA FUNCIONAL. Estudio de la expresión de genomas completos. GENETICA FUNCIONAL. Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement The Chipping Forecast. GENETICA FUNCIONAL.

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Presentation Transcript
Genetica funcional

GENETICA FUNCIONAL

Estudio de la expresión de genomas completos


Genetica funcional1

GENETICA FUNCIONAL

Bibliografía:

Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement

The Chipping Forecast


Genetica funcional2
GENETICA FUNCIONAL

  • 1) El entendimiento de los sistemas biológicos constituidos por miles de genes requiere la organización de las partes según sus propiedades:

    • + Similaridad de secuencia de DNA en las regiones codificantes y reguladoras

    • + Variaciones polimórficas entre especies y subgrupos

    • + Tiempo y lugar de expresión de los RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones fisiológicas y/o patológicas.

    • + Localización subcelular de los productos génicos.

  • 2) Este entendimiento precisa el desarrollo de técnicas de "visión global" de los procesos biológicos: estimación simultanea de todos los componentes.

    • + DNA chips (o DNA microarrays)

    • + Serial Analysis of Gene Expresion (SAGE)

    • + Differential Display (Expresión diferencial).

  • 3) Estas técnicas permiten estudiar en paralelo los niveles de expresión de muchos genes y generan información estática (donde se expresa un gen) y dinámica (como se relaciona la expresión de unos genes con otros).


Dna chips o dna microarrays
DNA Chips o DNA Microarrays

1) Evolución histórica:

+ Técnica de Shouthern: "Las moléculas de ácido nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse para extraer información de muestras de de ácidos nucleicos fijadas a un soporte sólido": Técnicas de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc.

+ Fijación de clones individuales de forma ordenada en filtros para localizar los clones deseados e investigar patrones de expresión de genes.

2) Innovaciones clave:

A) Utilización de soportes sólidos no-porosos, que permiten la miniaturización y la detección fluorescente.

+ Pueden inmovilizarse de forma automática hasta 10.000 cDNAs en un soporte microscópico e hibridarlo con sondas marcadas.

B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a alta densidad, de oligonucleótidos en dichas superficies.

+ Mediante técnicas fotolitográficas: matrices con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno confinado en una región de 20 µm2

+ Mediante la colocación in situ de los reactivos de síntesis por dispositivos similares los utilizados en las impresoras de chorro de tinta.

3) Usos propuestos:

A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.

+ cDNA arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.

+Oligonucleotide arrays: Idem pero por síntesis in situ de oligonucleótidos

B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide Polymorfisms).

+ Oligonucleotide arrays: Para secuenciación en paralelo.





Impresi n o espoteo
Impresión o “espoteo”

  • Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio






Light directed oligonucleotide synthesis
Light directed oligonucleotide synthesis


Genetica funcional

Light directed oligonucleotide synthesis



Usos propuestos para los dna chips o dna microarrays
Usos propuestos para los DNA Chips o DNA Microarrays

A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.

+ cDNA o oligonucleotide arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.

B) Secuenciación

+ Oligonucleotide arrays

C) Genotipado

+ Oligonucleotide arrays


Cdna microarray

Bacteria grown in culture

Label cDNA from bacteria with red Cy3 dye

Bacteria from sit of infection.

Label cDNA from bacteria with green Cy5 dye

co-hybridization of cDNAs to DNA microarray

RNA binds to corresponding gene

cDNA microarray

Blank-not expressed

Green- expressed in infection only

Red- expressed in culture only

Yellow- expressed in

Both, culture and infection





Cdna microarrays detection limits
cDNA Microarrays Detection Limits







Genotipado
Genotipado de señal

Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar 3.000 loci bialélicos


Genetica funcional

SAGE de señal

Serial Analysis of Gene Expression


Genetica funcional
SAGE de señal

  • Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o 10 pares de bases contiene suficiente información para identificar un transcrito.


Genetica funcional

Cleave with anchoring enzyme (AE) de señal

Bind to streptavidin beads

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AAAAA

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CATG

CATG

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GTAC

GTAC

TTTTT

TTTTT

Divide in half Ligate to linkers (A+B)

CATG

CATG

AAAAA

AAAAA

GTAC

GTAC

TTTTT

TTTTT

Cleave with tagging enzyme (TE). Blunt Ends

Ligate and amplify with primers A and B

A

A

A

A

A

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Cleave with anchoring enzyme

Isolate Ditags. Concatenate and clone

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AE is Nia III

TE is Fok I