Peroxisomal Fatty Acid Oxidation Is Not Essential for Virulence of Candida albicans

1. Peroxisomal Fatty Acid Oxidation Is Not Essential for Virulenceof Candida albicans K. Piekarsk, E. Mol, M. van den Berg, G. Hardy, J. van den Burg, C. van Roermund, D. MacCallum, F. Odds, and B. Distel Departments of Medical Biochemistryand Genetic Metabolic Diseases,Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands, and Aberdeen Fungal Group, School of Medical Sciences, Institute of Medical Sciences, Aberdeen, United Kingdom Received 30 March 2006 / Accepted 29 August 2006 Julien Goret. Master 2 Immunologie-Microbiologie.

2. Candida albicans • Caractères généraux : • Levure diploïde • Normalement saprophyte • Flore commensale  muqueuses • Muqueuses buccale et oro-pharyngée • Tractus gastro-intestinal • Muqueuse vaginale • Passage de l’état commensal à pathogène opportuniste • Pénétration tissulaire  candidémie

3. Candida albicans • Défenses de l’hôte : immunité innée • Macrophages • Polynucléaires neutrophiles • Ex vivo, survie dans phagolysosome • Adaptation : reprogrammation du métabolisme • Arrêt glycolyse  Néoglucogenèse • Cycle du glyoxylate • Β-oxydation des acides gras Phagocytose Péroxysome

4. Le péroxysome chez C. albicans • Organite cellulaire, présent chez tous les eucaryotes • Pas de matériel génétique : • 32 protéines codées par les gènes nucléaires PEX • Contiennent PTS 1 ou 2 qui permettent l’import respectivement par Pex5p et Pex7p • Rôle : détoxification de la cellule fongique • Métabolisme des lipides : β-oxydation

5. β-oxydation • Seulement dans le péroxysome • Pas dans la mitochondrie • Permet la production de glucose : • Conversion des acides gras Cn du lysosome • Production d’acétyl-CoA en C2 • Prise en charge dans le cycle de Krebs • FOX2 enzyme multifonctionnelle de la β-oxydation

6. Cycle du glyoxylate Remarque : le transport de ICL1 et MLS1dans le péroxysome est notamment médié par PEX5 grâce PTS1

7. But de l’expérience • Le péroxysome semble avoir un rôle important dans la virulence : échappement par adaptation du métabolisme • L’altération des fonctions du péroxysome de C. albicans peut-elle affecter la virulence de l’agent infectieux ? • Méthode : inactivation ciblée des gènes • PEX5  transport intrapéroxysome des protéines ayant un PTS • FOX2  enzymes de la β-oxydation • ICL1  enzyme du cycle du glyoxylate

8. Matériel et méthodes • Identification des gènes PEX5 et FOX2 chez C. albicans • Construction de C. albicans mutants nuls par invalidation ciblée des gènes • Caractérisation phénotypique • Etude de la virulence par inoculation à la souris

9. Identification des gènes Pex5 et Fox2 • BLASTp avec S. cerevisiae • Identification de : • Pex5-like ORF (orf19.5640) CaPEX5 : protéine de 593 aa • Fox2-like ORF (orf19.1809)  CaFOX2 : protéine de 907 aa • Respectivement 41 et 52 % d’homologie avec S. cerevisiae

10. Matériel et méthodes • Identification des gènes PEX5 et FOX2 chez C. albicans • Construction de C. albicans mutants nuls par invalidation ciblée des gènes • Caractérisation phénotypique • Etude de la virulence par inoculation à la souris

11. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Technique décrite par Wilson et al. : • Intégration de produits de PCR par recombinaison homologue • Construction d’une cassette : • Courtes séquences d’homologie aux extrémités avec le gène d’intérêt : 60 à 70 pb • Marqueur auxotrophique : ARG4 et HIS1 PEX5 3’ 5’ ARG4 ou HIS1

12. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Technique décrite par Wilson et al. : • Invalidation de ARG5 chez C. albicans • Transformation : insertion d’une cassette HIS1 • Sélection sur milieu spécifique HIS du mutant hétérozygote • 2nde transformation : insertion d’une cassette URA3 • Sélection sur milieu spécifique URA du mutant homozygote • Marqueurs utilisés : ARG4 & HIS1

13. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Construction moléculaire pour l’invalidation des gènes PEX5, FOX2 et ICL1 Amplification par PCR du gène d’intérêt : PEX5, FOX2 ou ICL1 Amplification par PCR du marqueur auxotrophique : ARG4 ou HIS1 Clonage dans un plasmide Digestion enzymatique Obtention d’un plasmide délété par digestion Plasmide recombinant

14. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Construction de C. albicans révertants pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Mutants nuls issus souche BWP17 n’exprimant pas URA3 • Réintroduction du gène associé à URA3 par transformation • Sélection sur uracile Problème : • Position génomique URA3  différents niveaux d’expression • Introduction dans une région commune à toutes les souches : locus ura3 5’ PEX5 URA 3’

15. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Souches obtenues :

16. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Confirmation de l’intégration des cassettes par Southern Blot : PEX5

17. Construction de C. albicans mutants nuls pour PEX5, FOX2 & ICL1 • Confirmation de l’intégration des cassettes par Southern Blot : FOX2

18. Matériel et méthodes • Identification des gènes PEX5 et FOX2 chez C. albicans • Construction de C. albicans mutants nuls par invalidation ciblée des gènes • Caractérisation phénotypique • Microscopie électronique • Capacité de culture sur des milieux ne contenant que des acides gras : acide oléique • Détermination des caractéristiques de l’activité de la β-oxydation • Etude de la virulence par inoculation à la souris

19. Caractérisation des mutants nuls pex5 et fox2 par microscopie électronique • Délétion PEX5 entraîne une mauvaise localisation des protéines contenant un PTS • Anticorps dirigés contre Catalase PTS1 et Thiolase PTS2

20. Capacité de culture sur des milieux contenant de l’acide oléique • Préculture sur milieu glucosé • Milieu dont la seule source de C est un AG : acide oléique • 0,67 % YNB • 0,2 % Tween 40 • 0,12 % acide oléique • Mesure de la densité optique pendant 24h PEX5 et FOX2 sont nécessaires au métabolisme des AG Ces gènes ne sont présents qu’en un seul exemplaire

21. Activité de la β-oxydation • Mesure de l’oxydation d’acide oléique marqué au 14C • Référence : activité de souche WT BWP17 = 100 % PEX5 et FOX2 sont nécessaires à la β-oxydation Un seul exemplaire des gènes

22. Matériel et méthodes • Identification des gènes PEX5 et FOX2 chez C. albicans • Construction de C. albicans mutants nuls par invalidation ciblée des gènes • Caractérisation phénotypique • Etude de la virulence par inoculation à la souris

23. Etude virulence des mutants nuls pex5 et fox2 par inoculation à la souris • 4 études indépendantes avec 6 à 12 souris femelles BALB/c • Méthode : • Injection de 1,6 à 4,5 x 105 CFU/g dans la veine de la queue • Suivi du poids pendant 28j après inoculation • Si perte de 20 % du poids ou signes irréversibles de l’infection  souris est tuée • Pour tous les animaux, prélèvements des reins droit et gauche et cerveau • Pesée • Homogéinisation dans une solution saline • Détermination de la charge fungique

24. Etude virulence des mutants nuls pex5 et fox2 par inoculation à la souris • Résultats : Survivants pex5Δ/pex5Δ, fox2Δ/ fox2Δ et fox2Δ/ fox2Δ réintégrant en comparaison des survivants avec les souches BWP17 et SC5314.  La fonction de FOX2 est nécessaire pour une virulence totale  Le mutant nul pex5 ne montre pas de diminution de la virulence

25. Etude virulence des mutants nuls pex5 et fox2 par inoculation à la souris • Résultats : Comparaison de la virulence entre icl1Δ/icl1Δ, icl1Δ/icl1Δ réintégrant et mutant fox2Δ/ fox2Δ. Degré similaire d’atténuation de la virulence entre les mutants nuls fox2 et icl1 : métabolisme péroxysomale a un rôle dans la virulence

26. Etude virulence des mutants nuls pex5 et fox2 par inoculation à la souris • Résultats : Charge fungique dans le cerveau et les reins chez les souris pour toutes les souches  Pas de différence significative

27. Etude virulence des mutants nuls pex5 et fox2 par inoculation à la souris • Résultats et discussion : • Pex5 est en contradiction avec les résultats de fox2 et icl1: • L’activité de la β-oxydation est diminuée • Virulence conservée / BWP17 • Hypothèse : utilisation d’une autre source énergétique que la β-oxydation • Culture sur des substrats non fermentables • Étalement sur agarose : • Glucose : témoin • Acétate • Éthanol • Lactate • Incubation à 28°C

28. Culture sur différentes sources de carbone • Résultats :  Le mutant pex5 peut utiliser des sources non fermentables de carbone sans utiliser la β-oxydation  La β-oxydation péroxysomale des AG n’est pas essentielle à la virulence de Candida albicans

29. Discussion • Autres voies métaboliques  acétyl-CoA : Lorenz et al.

30. Conclusion • Phagocytose par les macrophages et neutrophiles  diminution de la glycolyse chez C. albicans  néoglucogenèse • Activation de voies métaboliques du péroxysome • Β-oxydation des AG • Cycle du glyoxylate • Rôle est mis en évidence par des délétions concernant des enzymes clés : PEX5, FOX2 et ICL1 • Β-oxydation ne contribue qu’en partie à la virulence in vivo • L’acétyl-CoA peut être issu de sources non fermentables différentes du métabolisme des AG La β-oxydation péroxysomale des AG n’est pas essentielle à la virulence de Candida albicans

31. Merci de votre attention !