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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung

Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK. Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung. Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK. Transfektionsmethoden . Definitionen. Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien

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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung

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Presentation Transcript

  1. Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung

  2. Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK Transfektionsmethoden

  3. Definitionen Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien Transiente Expression Vorübergehende Expression z. B: Verlust bei Zellteilung („Verdünnung“)

  4. Transfektionmethoden • Methoden: • Retroviraler Gentransfer(eigentliche Bezeichnung: Transduktion) • Lipofektion • Elektroporation • CaPO4-Transfektion • Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

  5. Transfektionsmethoden • Methoden: • Retroviraler Gentransfer  dauerhafte Expression • Lipofektion  transiente • Elektroporation Expression • CaPO4-Transfektion • Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

  6. RNA-Strang RNA DNA Infektion & „Enthüllung“ Integration Reverse Transkription Retroviraler Gentransfer Retroviraler Lebenyzyklus:

  7. Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:

  8. Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:

  9. Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Einbringen des Plasmids durch Transfektion

  10. Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Einbringen des Plasmids durch Transfektion Virusproduktion

  11. Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion

  12. Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Reverse Transkription Infektion

  13. Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Reverse Transkription Infektion Integration

  14. Lipofektion Prinzip der Lipofektion: DNA + liposomales Reagenz Inkubation  Liposomen endozytotische Aufnahme Transient veränderte Zelle

  15. Zellsuspension DNA Elektroporation Prinzip der Elektroporation:

  16. Zellsuspension DNA Elektroporation Prinzip der Elektroporation:

  17. Zellsuspension DNA Elektroporation Prinzip der Elektroporation: Küvette zwischen Elektroden positionieren

  18. Zellsuspension DNA Elektroporation Prinzip der Elektroporation: Spannung und Kapazität einstellen

  19. Zellsuspension DNA Elektroporation Prinzip der Elektroporation: Puls auslösen

  20. Elektroporation Prinzip der Elektroporation: Zellen Puls auslösen DNA

  21. Elektroporation Prinzip der Elektroporation: Zellen DNA Aufnahme der DNA

  22. CaPO4-Transfektion Prinzip der CaPO4-Transfektion:

  23. CaPO4-Transfektion Prinzip der CaPO4-Transfektion:

  24. CaPO4-Transfektion Prinzip der CaPO4-Transfektion:

  25. CaPO4-Transfektion Prinzip der CaPO4-Transfektion:

  26. Nadja Züfle pädiatrische Hämatologie und Onkologie, CVK Transfektionsoptimierung am Beispiel der CaPO4-Transfektion

  27. Optimierung • AusgangsprotokollTrono Laboratories, Genf

  28. Optimierung • AusgangsprotokollTrono Laboratories, Genf • Welche Parameter sind wichtig? • Zelldichte • DNA-Menge • CaPO4-Menge • pH-Wert des Puffers • Inkubationszeit • andere (Temperatur der Reagenzien, Handhabung, Mengenverhältnisse, …)

  29. Optimierung 3. Ansatztabelle

  30. Optimierung 3. Ansatztabelle 4. Plasmid-DNA Zur Optimierung ein Plasmid mit Reportergen z.B. GFP  gute Auswertbarkeit im FACS

  31. Optimierung Protokoll – Tag 0 Ausaat 24 h vor der Transfektion Zellen splitten und mit der gewünschten Zelldichte aussäen (z.B. 3*106 Zellen auf einer 10 cm Platte)

  32. Optimierung • Protokoll – Tag 1 Transfektion • Zutaten pro Ansatz • je ein 10 ml Tube • 250 µl steriles Wasser • DNA (z.B. 40 µg für 3*106 Zellen) • 500 µl HBS • 250 µl 0,5 M CaCl2 • 1 ml Plastikpipette • Vortexer (so nah wie möglich an der Sterilbank oder sogar drunter) • Alle Reagenzien: Raumtemperatur!

  33. Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Mischen durch Pipettieren

  34. Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! Mischen durch Pipettieren

  35. Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde!  dann 35 Min. inkubieren bei RT Mischen durch Pipettieren

  36. Optimierung • Protokoll – Tag 2 Detoxifikation • 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen • warmes Medium!

  37. Optimierung • Protokoll – Tag 2 Detoxifikation • 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen • warmes Medium! Protokoll – Tag 3 - Auswertung Auswertung der Zellen im FACS • Anteil der lebenden Zellpopulation, die das GFP produziert? • Anteil der überlebenden Zellen?

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