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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung

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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung - PowerPoint PPT Presentation


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Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK. Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung. Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK. Transfektionsmethoden . Definitionen. Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien

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Presentation Transcript
slide1

Nadja Züfle

pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK

Transfektionsmethoden

und

Transfektionsoptimierung

slide2

Nadja Züfle

pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK

Transfektionsmethoden

slide3

Definitionen

Transfektion

Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien

Transiente Expression

Vorübergehende Expression

z. B: Verlust bei Zellteilung („Verdünnung“)

slide4

Transfektionmethoden

  • Methoden:
  • Retroviraler Gentransfer(eigentliche Bezeichnung: Transduktion)
  • Lipofektion
  • Elektroporation
  • CaPO4-Transfektion
  • Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)
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Transfektionsmethoden

  • Methoden:
  • Retroviraler Gentransfer  dauerhafte Expression
  • Lipofektion  transiente
  • Elektroporation Expression
  • CaPO4-Transfektion
  • Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)
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RNA-Strang

RNA

DNA

Infektion & „Enthüllung“

Integration

Reverse Transkription

Retroviraler Gentransfer

Retroviraler Lebenyzyklus:

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Verpackungszell-Linie

(alle Erbinformation für das „leere“ Virus)

Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

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Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“)

Verpackungszell-Linie

(alle Erbinformation für das „leere“ Virus)

Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

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Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“)

Verpackungszell-Linie

(alle Erbinformation für das „leere“ Virus)

Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

Einbringen des Plasmids durch Transfektion

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Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“)

Verpackungszell-Linie

(alle Erbinformation für das „leere“ Virus)

Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

Einbringen des Plasmids durch Transfektion

Virusproduktion

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Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

Infektion

slide12

Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

Reverse Transkription

Infektion

slide13

Retroviraler Gentransfer

Retroviren und Gentransfer:

Reverse Transkription

Infektion

Integration

slide14

Lipofektion

Prinzip der Lipofektion:

DNA + liposomales Reagenz

Inkubation  Liposomen

endozytotische Aufnahme

Transient veränderte Zelle

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Zellsuspension

DNA

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

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Zellsuspension

DNA

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

slide17

Zellsuspension

DNA

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

Küvette zwischen Elektroden positionieren

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Zellsuspension

DNA

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

Spannung und Kapazität einstellen

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Zellsuspension

DNA

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

Puls auslösen

slide20

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

Zellen

Puls auslösen

DNA

slide21

Elektroporation

Prinzip der Elektroporation:

Zellen

DNA

Aufnahme der DNA

slide22

CaPO4-Transfektion

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

slide23

CaPO4-Transfektion

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

slide24

CaPO4-Transfektion

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

slide25

CaPO4-Transfektion

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

slide26

Nadja Züfle

pädiatrische Hämatologie und Onkologie, CVK

Transfektionsoptimierung

am Beispiel der CaPO4-Transfektion

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Optimierung

  • AusgangsprotokollTrono Laboratories, Genf
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Optimierung

  • AusgangsprotokollTrono Laboratories, Genf
  • Welche Parameter sind wichtig?
  • Zelldichte
  • DNA-Menge
  • CaPO4-Menge
  • pH-Wert des Puffers
  • Inkubationszeit
  • andere (Temperatur der Reagenzien, Handhabung, Mengenverhältnisse, …)
slide29

Optimierung

3. Ansatztabelle

slide30

Optimierung

3. Ansatztabelle

4. Plasmid-DNA

Zur Optimierung ein Plasmid mit Reportergen

z.B. GFP  gute Auswertbarkeit im FACS

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Optimierung

Protokoll – Tag 0 Ausaat

24 h vor der Transfektion Zellen splitten und mit der gewünschten Zelldichte aussäen (z.B. 3*106 Zellen auf einer 10 cm Platte)

slide32

Optimierung

  • Protokoll – Tag 1 Transfektion
  • Zutaten pro Ansatz
  • je ein 10 ml Tube
  • 250 µl steriles Wasser
  • DNA (z.B. 40 µg für 3*106 Zellen)
  • 500 µl HBS
  • 250 µl 0,5 M CaCl2
  • 1 ml Plastikpipette
  • Vortexer (so nah wie möglich an der Sterilbank oder sogar drunter)
  • Alle Reagenzien: Raumtemperatur!
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Optimierung

Protokoll – Tag 1 Transfektion

250 µl steriles

Wasser

250 µl

CaCl2-Lösung

DNA (z.B. 40 µg)

Mischen durch

Pipettieren

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Optimierung

Protokoll – Tag 1 Transfektion

250 µl steriles

Wasser

250 µl

CaCl2-Lösung

DNA (z.B. 40 µg)

Kräftig vortexen

dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben

1 Tropfen pro Sekunde!

Mischen durch

Pipettieren

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Optimierung

Protokoll – Tag 1 Transfektion

250 µl steriles

Wasser

250 µl

CaCl2-Lösung

DNA (z.B. 40 µg)

Kräftig vortexen

dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben

1 Tropfen pro Sekunde!

 dann 35 Min. inkubieren bei RT

Mischen durch

Pipettieren

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Optimierung

  • Protokoll – Tag 2 Detoxifikation
  • 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen
  • warmes Medium!
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Optimierung

  • Protokoll – Tag 2 Detoxifikation
  • 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen
  • warmes Medium!

Protokoll – Tag 3 - Auswertung

Auswertung der Zellen im FACS

  • Anteil der lebenden Zellpopulation, die das GFP produziert?
  • Anteil der überlebenden Zellen?