Određivanje koncentracije nitrita Metodom po Green-u (1982)

1. Određivanje koncentracije nitrita Metodom po Green-u (1982)

2. Kada merimo koncentraciju nitrita?* najčešće, u slučaju kada nas zanima koncentracija NO Koji je značaj NO-a? • Jedan od glavnih signalnih molekula u nervnim ćelijama i imunom sistemu, bilo da deluje unutar ćelija gde se proizvodi, bilo da deluje na okolne ćelije. Utiče na neuralnu transmisuju. • Dovodi do relaksacije glatke muskulature krvnih sudova, tj. do vazodilatacije tako što deluje na enzim guanil ciklazu, stimulišući produkciju intracelularnog medijatora cGMP-a. • Može biti uključen u aktivaciju proteina S-nitrozilacijom

3. Azot oksid(NO) • Sintetiše se u različitim tipovima ćelija iz arginina aktivnošću NO sintaze (NOS) • Polu-život mu je samo nekoliko sekundi in vivo • Glavna metabolička sudbina NO je oksidacija do nitrata pod uticajem oksihemoglobina eritrocita i autooksidacija do nitrita • Nitrati i nitriti cirkulišu krvotokom i ekskretuju se urinom • Cirkulišući nitrati i nitriti ukazuju na produkciju NO • Mogu se meriti u serumu, urinu različitim metodama: kolorimetrijom, spektrofotometrijom, fluorimetrijom, gasnom i tečnom hromatografijom, masenom spektrofotometrijom

4. Šta se radi u našoj laboratoriji ? • Kultura Leydig-ovih ćelija • Ispitivanje signalnog puta NO- cGMP-steroidogeneza • Jedan od načina aktivacije ovog signalnog puta je stimulacija ćelija donorom NO – dipropilentriaminom (DPTA) • Kada se radi ispitivanje uticaja stresa na steroidogenezu, takođe se između ostalog meri i koncentracija nitrita zato što stres indukuje iNOS, proizvodi se NO. • Leydigove ćelije proizvode samo male količine NO, dok makrofage koje se nalaze u intersticijumu proizvode mnogo više NO

6. METODA PO GREEN-U Princip metode: nitriti reaguju sa Griess-ovim reagensom, pri čemu se dobija ljubičasta azo boja. Intenzitet boje zavisi od koncentracije nitrita. Ovom metodom se mogu određivati i nitrati. GRIESS-OV REAGENS • sulfanilamid (SA) Mw=172.2 1g / 100ml 5% H3PO4 • naftaletilendiamin (NEDA) Mw=259.2 0.1g / 100ml dH2O Rastvore spojiti u razmeri 1:1 i mešati na magnetnoj mešaliciu mraku na 4°C – 30 minuta.

7. STANDARDNA KRIVA • standard NaNO2 Mw=69 0.138g / 10ml dH2O 200mM 1000xR ↪ 10l + 9.99ml dH2O 2 x 100M 1ml STD (2 x 100M ) + 1 ml M199 100 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 50 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 25 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 12.5 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 6.25 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 3.125 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 1.56 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 0.78 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 0.39 M 2xR↪1ml STD + 1 ml M199 0.195 M

8. SLEPA PROBA: 100l M199 + 100l Griess-a UZORCI: 100l uzorka + 100l Griess-a STANDARDI: 100l standarda + 100l Griess-a INKUBACIJA: 10 minuta na sobnoj temperaturi MERENJE APSORBANCE NA FOTOMETRU: = 546nm

9. REDOSLED DODAVANJA U MIKROTITAR PLOČU • Oznaka well-a Šta dodajemo??? • 2A (slepa proba) 100l M199 + 100l Griess reagensa • 3A,4A 100l M199 + 100l Griess • 5A,6A 100l (STD 0,195M) + 100l Griess • 7A,8A 100l (STD 0,39M) + 100l Griess • 9A,10A 100l (STD 0,78M) + 100l Griess • 11A,12A 100l (STD 1,56M) + 100l Griess • 1B,2B 100l (STD 3,125M) + 100l Griess • 3B,4B 100l (STD 6,25M) + 100l Griess • 5B,6B 100l (STD 12,5M) + 100l Griess • 7B,8B 100l (STD 25M) + 100l Griess • 9B,10B 100l (STD 50M) + 100l Griess • 11B,12B 100l (STD 100M) + 100l Griess • 1C,2C 100l Uzorak 1 + 100l Griess • 3C,4C 100l Uzorak 2 + 100l Griess

11. Radioimunološka analiza (RIA) • Radioimunološka i njoj srodne analize predstavljaju neophodne istaživačke metode u mnogim naučnim oblastima: • imunologiji, • endokrinologiji i neuroendokrinologiji, • molekularnoj biologiji, • virusologiji, • farmakologiji, • kao i u drugim oblastima istaživanja vezanim za reprodukciju domaćih životinja, reprodukciju riba, detekciju hormona i njihovih ostataka u namirnicama životinjskog porekla.

12. Radioimunološka analiza (RIA) • zasniva se na originalnim zapažanjima Yalowa i Bersona (1953) da male koncentracije antitela na insulin mogu da se detektuju zahvaljujući njihovoj sposobnosti da vezuju radioaktivni insulin (insulin obeležen sa I-131). • RIA se koristi za određivanje velikog broja supstanci u uzorcima različitog porekla (krvni serum, mleko, plazma, tkivo...) i to: peptidnih hormona, ne-peptidnih hormona, cikličnih nukleotida, lekova, virusnih proteina, enzima.

13. Princip RIA • Nepoznata koncentracija antigena može da se odredi zahvaljujući fizičko-hemijskoj kompeticiji koja postoji između radioaktivno obeleženog (Ag*)i neobeleženog antigena (Ag) za ista vezna mesta na antitelu (Ab). • Neobeležena molekula antigenamože biti supstanca koja se koristi kao standard i koja se u poznatim količinama dodaje u reakciju, ili antigen iz uzorka čija se koncentracija određuje. • Sposobnost antigena, koji se koristi kao standard, da kompetituje saAg* za vezna mesta naAb, mora biti istovetna takvoj sposobnosti supstance čiju koncentraciju želimo da odredimo.

14. AgAb Postavljanje komponenti RIA u analizu Rastvor Ag- u sve epruvete ista količina (isti nivo radioaktivnosti) Rastvor Ab - u sve epruvete ista količina i to ona koja vezuje od 30-50% Ag u odsustvu neobeleženog Ag. RastvorS - rastuće koncentracije (S1 – S8), a nakon toga uzorci. S AgAb S

15. Ukoliko se u reakciji povećava količina neobeleženog Ag (tj. hormona koji ispitujemo), ograničen broj veznih mesta na antitelu se postepeno zasićuje i antitelo vezuje za sebe sve manju količinuAg*, što predstavlja proces kompetitivne inhibicije. • Ako ne postoji neka nespecifična inhibicija imunohemijskereakcije, smanjeno vezivanje obeleženog antigena (Ag*), govori o većem prisustvu neobeleženog Ag u reakciji.

16. Merenje • Veličina koja se može direktno meriti u reakcionom sistemu jeste radioaktivnost Ag* i radioaktivnostAg*-Ab • F - količina slobodnog Ag* • B – količina Ag* koji je formirao kompleks sa Ab • T – ukupna količina Ag*i predstavlja B+F

17. Prisustvo neobeleženog antigena inhibira formiranje obeleženog kompleksa. Stepen inhibicije je srazmeran prisutnoj količini neobeleženog antigena. • Izražava se odnosom: B/F, B/T ili B/B0 • B0 – maksimalno vezivanje Ag* za Ab u odsustvu neobeleženog Ag • Da bismo odredili nepoznatu koncentraciju Ag, stepen kompetitivne inhibicije u nepoznatom uzorku poredimo sa stepenom kompetitivne inhibicije standarda.

18. Razdvajanje slobodnog od vezanog antigena • Može se vršiti na više različitih načina, a u našoj laboratoriji koristi se metoda koja podrazumeva korišćenje AKTIVNOG UGLJA. • Aktivni ugalj adsorbuje i taloži sve slobodne obeležene antigene, tako da u supernatantu ostaju samo formirani KOMPLEKSI Ag-Ab i Ag*-Ab • Izmerena radioaktivnost supernatanta obrnuto je proporcionalna količini prisustnog neobeleženog Ag (tj.HORMONA koji ispitujemo)