Metody histologického studia

1. Metody histologického studia (biologická technika)

2. 1. Histologie Histologie - z řečtiny: histos = tkáň, logos = nauka - vědní disciplína, která se zabývá studiem mikroskopické struktury živočišných tkání a orgánů mnohobuněčných organismů - předmět studia na lékařských fakultách Zařazení histologie: * biologie * morfologie * histologie * cytologie - nauka o buňce * obecná histologie - nauka o tkáních * speciální histologie (mikroskopická anatomie) * histotechnologie Rozdělení histologie: - obecná - nauka o struktuře základních typů tkání - speciální - studuje mikroskopickou stavbu jednotlivých orgánů

3. Příbuzné a související obory: • buněčná biologie - studuje struktury menší než buňka, hlavně organely • histopatologie - mikroskopická struktura nemocných tkání; důležitý nástroj patologické • anatomie • histochemie - chemické pochody probíhající ve tkáních • imunohistochemie - využívá antigeny a protilátky na bližší poznání struktur • anatomie - struktura orgánů a orgánových soustav • morfologie - studuje celé organismy • Využití: • v medicíně při zkoumání patologických změn tkáně (zhoubné bujení) • pomocí histochemických technik lze prokázat přítomnost látek (např. enzymů) • v buňkách a tkáních a lépe tak porozumět chemickým procesům v organismu

4. 2. Tkáň • soubor morfologicky podobných buněk, které plní určitou funkci • buňky tvořící tkáň mohou stejného typu, nebo existují tkáně tvořené buňkami tvarově • i funkčně rozdílnými • základní stavební složka živočišného těla • Typy tkání: • epitelová (krycí) • pojivová • * vlastní pojivová tkáň • * vazivo • * kost • * chrupavka • * tělní tekutiny • * krev • * míza • * tkáňový mok • svalová • * hladká • * příčně pruhovaná epitel kolagenové vazivo měkkýše

5. nervová • * neurony • * neuroglie • tekutá (trofická) • * krev • * krvomíza • * míza kost krev

6. 3. Histologické metody Jen malý počet živočišných tkání a buněk je vhodný pro přímé histologické studium. Aby bylo možné studovat různé tkáně a využít současné rozlišovací schopnosti světel- ných mikroskopů, je nutné zhotovit preparáty, tj. tkáně šetrně a rychle usmrtit, připravit dostatečně tenké řezy a ty obarvit. Postup při zhotovení řezových preparátů: 1. Odběr tkáně 4. Zalití do krájecího prostředí 2. Fixace 5. Krájení 3. Vypírání fixáže 3.1 Fixační činidla - slouží k rychlému usmrcení buněk a tkání - volba závisí na záměru studia, neboť ne všechny fixační látky vhodně fixují různé tkáňové komponenty Fixace- fyzikální (zmrazení při -170°C) FREEZING-DRYING - chemická - těžké kovy (chlorid rtuťnatý, dvojchroman draselný, osmium tetroxid) - aldehydy (formaldehyd, glutaraldehyd) - jiné organické látky (trinitrofenol, kyselina octová, kys. trichlor- octová, etylalkohol, metylalkohol)

7. Chemická fixace – činidla: • minerální kyseliny – kys. osmičelá • - kys. chromová • soli kovů – dvojchroman draselný • - sublimát, chlorid rtuťnatý • organické kyseliny – kys. octová ledová • - kys. trichloroctová • - kys. pikrová • organické redukční prostředky – etylalkohol • - metylalkohol • - formaldehyd

8. Nejpoužívanější fixační tekutiny- pro světelnou mikroskopii Formaldehyd 4% Bouinova tekutina - trinitrofenol+formol+kys.octová (ledová)+voda Susa - chlorid rtuťnatý+chlorid sodný+kys.trichloroctová+kys.octová (ledová)+formol + voda Zenkerova tekutina - chlorid rtuťnatý+dvojchroman draselný+síran sodný+kys.octová (ledová)+voda Gendreova tekutina - trinitrofenol+formol+kys.octová (ledová)+etylalkohol+voda Metanol - pro elektronovou mikroskopii Glutaraldehyd (1-2,5%) Glutaraldehyd + postfixace osmium tetroxidem Glutaraldehyd + formaldehyd Glutaraldehyd + formaldehyd + postfixace osmium tetroxidem

9. 3.2 Vypírání fixáže - je vždy nutné po použití většiny fixačních tekutin, protože zbytky fixáže ve tkáních jsou překážkou při dalším zpracování preparátů ( snížení barvitelnosti, ztížení zalévání - objekty fixované směsmi s dvojchromanem draselným se vypírají vodovodní vodou, směsi s kys. pikrovou v 70-80% alkoholu, s kys. trichloroctovou v 96% alkoholu - doba vypírání je předepsaná pro každou fixáž - probíhá zpravidla ve zkumavkách, popř. ve větších kádinkách 3.3 Zalévání - pro zhotovení dostatečně tenkých a kvalitních řezů pro studium je nutné tkáň zalít do média, které ji zpevní a vytvoří homogenní blok vhodný ke krájení - pro světelné mikroskopické studium bývají řezy tlusté 4 - 20 µm, pro elektronmikr. účely zpravidla 100 nm a tenčí Používaná média - světelná mikroskopie: - parafin - celloidin (nitroceluloza) - zmrazení a krájení na mikrotomu (méně časté) - elektronová mikroskopie: - epoxidové nebo polyesterové pryskyřice

10. 3.4 Krájení na mikrotomech Mikrotom - jednoduchý přístroj, kde je nůž obvykle veden v rovině proti bloku a blok je po každém řezu posunován šroubem do výšky - nebo je nůž pevný a blok je jednak posunován proti ostří nože do výšky, jednak se pohybuje proti ostří nože Po ukrojení řezu - z parafinového bloku - je tento řez napnut na kapce vody a přilepen na podložní sklo. Celloidinové řezy jsou štětečkem přenášeny do 70% alkoholu, zmrazené řezy do nádobky s destilovanou vodou. K lepení parafinových řezů na podložní skla se nejčastěji užívá bílek - glycerin, někdy želatina nebo syntetická lepidla. Tyto řezy po nalepení a usušení musí být odparafinovány a převedeny zpět do vody. Ve většině případů následuje barvení...

11. mikrotom zn. Leica laserový mikrotom