1 / 32

Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym

EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka. Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym. Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka,

luann
Download Presentation

Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Laboratoryjne metodywykrywaniawirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy

  2. NOROWIRUS NOROVIRUS L L ROTAVIRUS ROTAWIRUS J ADENOVIRUS ADENOWIRUS EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka J Spożycie (z płynami) Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Kontakt (podczas mycia) Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Oddechowa Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality

  3. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Ocena ryzyka *Podstawy naukowe Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka Struktura ramowa analizy ryzyka Źródło: WHO Food Safety odpowiednie metody

  4. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dzisiaj nie będę mówić o… Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach Liczba koloniiDIN EN ISO 6222 E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3 DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2 Pseudomonas DIN EN 12780 aeruginosa ... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody,badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)

  5. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka • badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNA • pobieranie próbek wody do analizy wirusów • oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu • filtra z włókna szklanego • ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa • rola inhibitorów środowiskowych • wykrywanie wirusów metodami PCR • badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej Phage MS2

  6. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001 Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001 Fagi B. fragilisDIN EN ISO 10705-4:2001 Fagi F+RNA F-Pilus F+ Fagi somatyczne Bacterium Bacterium

  7. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym

  8. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- FagiF+RNA Fagi somatyczne DIN 10705-1 10705-02 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- SzczepSalmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 ) Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholten‘s Agar (TYGA) ( MSA ) Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml 250 µg/ml Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml Fag wzorcowy:MS2PhiX174 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

  9. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Morfologia płytek bakteriofagów Fag138 PRD1 PhiX174 MS2

  10. C.Fuchs EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Morfologia płytek bakteriofagów Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii

  11. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego PhiX 174 Ar + Bri „Karta przewodnia”Kolifag somatyczny 110 100 90 80 70 pfu / ml 60 50 40 30 20 9.7.08 7.9.08 30.5.08 19.6.08 29.7.08 18.8.08 27.9.08 6.11.08 10.5.08 20.4.08 17.10.08 26.11.08 16.12.08 Data x-3s x-2s x x+2s x+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml

  12. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Monitorowanie wirusów – pobieranie prób Związki chemiczne Rozkład statystyczny Wirusy Skupiska!

  13. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Próbobranie

  14. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów 10-litrowa próba wody ( DNA / RNA ) próbka wody surowej Wykrywanie wirusa metodą PCR • Pobieranie prób wody o dużej objętości • Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) • Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów • Testy wykrywające wirusy Infectivity assays

  15. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody Cechy wirusa Metody Polarność powierzchniowa kapsydu Adsorpcja / Wymywanie Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Gęstość Ultrawirowanie

  16. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego

  17. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka W terenie…

  18. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Włókno szklane – badania polowe dużych objętości Próba wody: 10 litrów 1000 litrów

  19. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska

  20. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie DNA i RNA liza elucja etapy mycia Bufor do lizy 2x 50 µl Bufor do elucji kroki powtarzane 5 razy Krzemionka Próbka 5ml 5 min 60°,1400 rpm

  21. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi Wirus RNA Wirus DNA Zdjęcia:dzięki uprzejmości J.Y. Scro

  22. Odwrotna transkrypcja EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Amplifikacja informacji genetycznej wirusów DNA RNA Białko 5’---CTCAGCGTTACCAT---3’ 3’---GAGTCGCAATGGTA---5’ 5’---CUCAGCGUUACCAU---3’ N---Leu-Ser-Val-Thr---C DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja

  23. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie wirusów metodami PCR konwencjonalne PCR (jakościowe) DNA / RNA PCR czasu rzeczywistego (ilościowe)

  24. Wirusy DNA Wirusy RNA PCR RT-PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR)

  25. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Nested (RT)-PCR NOROWIRUS (nested RT-PCR) ADENOWIRUS (nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R)

  26. Adenowirus 41 wzorzec 102 - 106kopii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Real-Time TaqManTM PCR Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu • Potrzebne są tylko: (1) matryca(próbka DNA) • (2) nieoznaczona para dla starterów • (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana • 2 fluorochromami (np. reporter FAM iwygaszacz TAMRA) • (4) Mastermix (koktail odczynników)

  27. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Real-time PCR 1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10 Testy / próbki: Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiskaczęsto negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych

  28. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie zakaźności adenowirusa • Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa • zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach • następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR) (A. Heim)

  29. J L EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Metody wykrywania wirusa Metoda wykrywania Hodowla komórkowa RT-PCR ICC-PCR J J L Skraca czas wykrywania J J Wykrywa zakaźnego wirusa J L L Wykrywa jedynie żywe organizmy L J J Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli L J J Odporna na wpływ substancji hamujących PCR J J L O zwiększonej czułości

  30. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie zakaźności enterowirusa a) TestTCID50b)Test łysinkowy kontrolnaCVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych

  31. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Podstawowe techniki monitorowania wirusów - wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA • systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) • systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności Techniki zaawansowane: - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa

  32. EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dziękuję Państwu!

More Related