t p n 8 dise o de oligonucle tidos l.
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T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos

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T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos. Objetivo: Diseño de oligonucleótidos adecuados para la amplificación mediante PCR de un fragmento interno del gen rpoS en Ps. alcaligenes. RpoS o  S.

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Presentation Transcript
slide2

Objetivo: Diseño deoligonucleótidos adecuados para la amplificación mediante PCR de un fragmento interno del gen rpoS en Ps. alcaligenes

slide3

RpoS o S

Genes que confieren resistencia al estrés, genes involucrados en re-arreglos morfológicos y genes que provocan cambios en el metabolismo celular

RpoS

Estrés: ayuno en nutrientes, pH ácido, alta osmolaridad

procedimiento
Procedimiento
  • En base de datos de secuencias proteicas buscar secuencias correspondientes a RpoS de Pseudomonas.
  • Elegir 4 de estas secuencias y armar con ellas un archivo en formato FASTA
  • Buscar las regiones de homología utilizando el ClustalW
procedimiento6
Procedimiento

4) Elegir regiones de homología situadas a una distancia adecuada (50 aa = 150 nucleótidos)

5) Reconstruir la secuencia nucleotídica de los nucleótidos elegidos, teniendo en cuenta los diferentes codones para un mismo aminoácido y el uso de codones para P. alcaligenes

ejemplo
Ejemplo
  • Secuencia aminoacídica elegida
  • PDA(A o E)WDG

2) Reconstrucción de secuencia nucleotídica

slide8

A (Ala)

R (Arg)

N (Asn)

D (Asp)

C (Cys)

Q (Gln)

E (Glt)

GCA

GCC

GCG

GCT

CGA

CGC

CGG

CGT

AGA

AGG

AAC

AAT

GAC

GAT

TGC

TGT

CAA

CAG

GAA

GAG

G (Gly)

H (His)

I (Ile)

L (Leu)

K (Lys)

M (Met)

F (Fen)

GGA

GGC

GGG

GGT

CAC

CAT

ATA

ATC

ATT

CTA

CTC

CTG

CTT

TTA

TTG

AAA

AAG

ATG

TTC

TTT

P (Pro)

S (Ser)

T (Thr)

W (Trp)

Y (Tyr)

V (Val)

CCA

CCC

CCG

CCT

TCA

TCC

TCG

TCT

AGC

AGT

ACA

ACC

ACG

ACT

TGG

TAC

TAT

GTA

GTC

GTG

GTT

Código genético

slide10

AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGlnGATGAAGGTTTTCTTTCTTATTGTTGGCTTCCTCATCAA  C  G  C  CT CAGC  C  C   T C  C  C  G         A     A  A           A  A          G     G  G           G  G

Elegir la region de 18 a 21 nucleotidos menos “degenerada”

Un total de 32 oligonucleotidos se generan para dar lugar al peptido .

TATTGTTGGCTTCC

TACTGTTGGCTTCC

TATTGCTGGCTTCC

TACTGCTGGCTTCC

etc.

slide11

Nomenclatura para nucleótidos degenerados

Nucleótidos degenerados:

B = C ó G ó T

D = A ó G ó T

H = A ó C ó T

K = G ó T

M = A ó C

N = A ó C ó G ó T

R = A ó G

S = G ó C

V = A ó C ó G

W = A ó T

Y = C ó T

Nucleótidos complementarios

C – G

A - T

B – V

D - H

K – M

N - N

R – Y

S – S

W –W

slide12

Para diseñar primers

  • Tamaño del oligonucleótido y del producto
  • Temperatura de fusión (Tm)
  • Especificidad
  • Secuencias complementarias
  • Contenido en G/C y cadenas de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G)
  • Secuencia 3’ terminal.
  • Secuencia 5’ terminal y regiones centrales
slide13
Tamaño del oligonucleótido

18 a 24 bases

Temperatura de fusión (Tm)

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Tann: 5- 8 °C más baja que la de fusión

slide14
Contenido en G/C

45% al 55%

Ideal mezcla al azar un contenido en

GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm estaría en el rango de 56°C – 62°C).

  • Complementariedad

NO estructuras secundarias o dímeroso doble cadena

  • Secuencia 3’-terminal

CG Clamp

  • Secuencia 5’-terminal y regiones centrales

CG Clamp

slide15

Temperatura de fusión (Tm)

TmForward = TmReverse

Tm = 55-62ºC

T hibridación ~ 5-8ºC menos que la Tm

Tamaño del primer

12-30 b, óptimo 18 a 24 b

Distancia entre primers

10 b-10 kb

Contenido en G+C

>= secuencia diana; ideal del 45% al 55%

“cepo GC” en 3’

termina en T; G o C en dos (máx.) de cinco últimas bases

“cepo GC” en 5’

incluir varias G o C en las últimas bases

Lugares de apareamiento de de primers

únicos

Resumén de Criterios “positivos” para el diseño de primers

slide21

Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Uso del programa DNAMAN