Sistema Membranar

1. Sistema Membranar Sistemas Membranares Citoplasmáticos: Estrutura, Função e Transporte Membranar -Vesículas de Transporte-

2. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções • As vias biossintéticas das células eucarióticas são constituídas por estruturas membranares que realizam as funções de: • - Síntese, modificação • - libertação/transporte de proteínas solúveis e proteínas membranares, para o seu destino • Vesículas • 50 a 75 nm • Origem: individualização das saliências de membranas dadoras • Fim: fusão com membranas receptoras

3. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções • Vesículas • Apresentam na sua superfície proteínas que: • - funcionam como um mecanismo molecular que leva ao encurvar da membrana e formar a vesícula • - são um mecanismo para selecção dos componentes a ser transportados • - intervêm no mecanismo molecular para direccionar a vesícula e para a ancorar à membrana alvo

4. COP II –(RER)Golgi COP I –(Golgi)RER Vesículas com clatrina –(TGN)destino final(endossomas, lisossomas) Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções COP – “coat protein”

5. COP II – RER Golgi Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções As vesículas COP II contém proteína com 5 subunidades Anticorpos contra estas proteínas impedem a formação das vesículas mas não têm efeito no transporte das vesículas Estas vesículas são capazes de seleccionar o material adequado para ser transportado

6. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções COP II - Selecção de componentes para transportar As proteínas de cobertura ligam-se a sequências sinal, localizadas nos domínios citosólicos de proteínas integrais do RE O terminal luminal das proteínas integrais (transmembranares) ligam proteínas solúveis (proteínas de secreção) no lúmen do RE A proteína Sar - Liga GTP (guanosina trifosfato) - Apresenta função reguladora (formação e desorganização das vesículas) A forma inactiva contém GDP ligada. A troca de GDP por GTP, activa Sar e promove a sua ligação à membrana do RE A ligação de Sar permite a ligação das outras proteínas de “cobertura” e posteriormente a formação da vesícula com “cobertura” COP II

7. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções

8. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções COP II - Desorganização das "coat" vesículas A proteína Sar - Liga GTP (guanosina tri-fosfato) - Apresenta função reguladora (formação e desorganização das vesículas) Antes da fusão das vesículas COP II com a membrana alvo, é necessário a desorganização dos componentes membranares de cobertura da vesícula e libertação destes no citoplasma Pensa-se que a desorganização é desencadeada pela hidrólise da molécula de GTP e consequente produção da subunidade Sar-GDP, que possui menor afinidade pela membrana da vesícula Após a dissociação da Sar-GDP da membrana, ocorre a libertação das outras proteínas de cobertura das COP II.

9. Golgi RER Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções Estas vesículas foram descobertas em células tratadas com moléculas análogas à GTP, mas que não podem ser hidrolisadas. Nestas condições as vesículas COP I acumulam-se nestas células tratadas e podem ser isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Evidenciando que também estas vesículas contém proteína capaz de ligar GTP(ARF1) e que é necessário hidrolisar GTP para promover a desorganização das proteínas de cobertura COP I

10. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções COP I Retenção e Retorno de Proteínas Residentes Se as vesículas se formarem continuamente a partir dos compartimentos membranares então como será possível manter a composição desse compartimento? O que determina que uma determinada proteína permaneça no RE ou prossiga para o complexo de Golgi? As proteínas permanecem num determinado compartimento por: -retenção das moléculas residentes que são excluídas das vesículas de transporte (integrando grandes complexos de difícil incorporação em vesículas) - retorno das moléculas “que escaparam”, para o compartimento onde normalmente residem

11. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções COP I Retenção e Retorno de Proteínas Residentes Proteínas residentes no RER (lúmen e membranares) possuem sequências sinal no C-terminal que servem como - Sinais de Retorno, que asseguram o seu regresso ao lúmen do RE A dissulfeto isomerase e chaperones (proteínas solúveis no RE) possuem a sequência Lys-Asp-Glu-Leu ou KDEL no C-terminal. O receptor da PRS (proteína de reconhecimento de sinal,proteína membranar) possuí no C-terminal uma sequência sinal de retorno – KKXX, (K=Lys e X=qualquer aminoácido)

12. (ARF1) Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções COP I O retorno das proteínas é realizado quando as proteínas solúveis do RE se ligam ao receptor da sequência KDEL (inserido na membrana do compartimento cis-Golgi) O receptor de KDEL vai ligar-se às proteínas de cobertura das COP I, e todo o complexo volta para o RE. O receptor possui a sequência KKXX, pois é uma proteína integral

13. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções Vesículas de Clatrina Como uma determinada proteína, sintetizada no RE é dirigida para um destino celular específico? A escolha das proteínas sintetizadas e modificadas ocorre no TGN (Trans Golgi Network) e é também este compartimento o responsável pela produção das vesículas de clatrina

14. Transporte Vesicular Tipos de Vesículas e suas Funções Vesículas de Clatrina Estas vesículas possuem: - uma estrutura externa constituída pela proteína clatrina - uma estrutura interna composta por um complexo de proteínas designadas por – adaptador. O complexo clatrina-adaptador liga-se a um receptor membranar específico para o composto a ser transportado Estas interacções permitem que materiais específicos do lúmen do TGN fiquem concentrados nas vesículas de clatrina

15. Endereçamento das Proteínas Lisossomais Papel das vesículas de clatrina Funciona como sequência sinal (manose-6-fosfato)

16. Endereçamento das Proteínas Lisossomais • Síntese em ribossomas no RER • Fosforiladas no complexo de Golgi : adição de Pi à manose da cadeia de açucares da N-glicosilação • Fosforilação (sinal de reconhecimento) • receptores de manose-6-fosfato (MPRs) são proteínas membranares concentradas nas projecções de clatrina do TGN. Interagem com as proteínas lisossomais (lúmen) e com os adaptadores (citoplasma) • Receptores desligam-se das proteínas próximo dos lisossomas • Receptores retornam ao TGN para nova carga • Existem MPRs na membrana plasmática que ligam proteínas lisossomais do espaço extracelular

17. Endereçamento das vesículas para compartimentos específicos Fusão Membranar • As vesículas deslocam-se ligadas a microtubulos • Proteínas fibrosas que estabelecem o 1º contacto entre a vesícula e a membrana alvo, via proteínas Rab que ligam GTP e que contribuem para a especificidade da ligação • A ancoragem por uma grande família de proteínas integrais – SNARE.

18. Endereçamento das vesículas para compartimentos específicos Fusão Membranar • A fusão selectiva garante o endereçamento correcto • Proteínas SNARE • (envolvidas no transporte vesicular) • v-SNARE(sinaptobrevina) • (localizadas nas membranas das vesículas) • t-SNARE(Syntaxin e SNAP-25) • (localizadas em membranas receptoras de diferentes compartimentos)

19. Endereçamento das vesículas para compartimentos específicos Fusão Membranar Uma v-SNARE numa vesícula do RE apenas deve interagir com uma t-SNARE das cisternas cis Golgi, e não com uma t-SNARE na membrana lisossomal Recentemente foi verificado que as proteínas-GTP - Proteínas Rab- possuem um efeito de regulação no processo de fusão membranar

20. SNAP 25 LER Mecanismo de fusão membranar Vesículas de neurotransmissores A ligação da vesícula à membrana alvo é iniciada pela ligação do domínio citosólico da v-SNARE ao domínio citosólico do complexo t-SNARE/SNAP25 Formando um complexo enrolamento dos domínios em hélice alfa das proteínas intervenientes Uma proteina Rab (ligadora de GTP) presente na membrana da vesícula pode funcionar como reguladora ajudando o processo de fusão membranar

21. Mecanismo de fusão membranar Vesículas de neurotransmissores LER A formação do complexo de fusão necessita da interacção das proteínas t-SNARE e v-SNARE e hidrólise de ATP No entanto o processo da fusão das duas membranas ainda não se encontra complemente esclarecido No passo 4 e após fusão os complexos t-SNARE/v-SNARE/SNAP25 devem dissociar-se para que estas proteínas possam catalisar passos posteriores de fusão Em 5) novas vesículas contendo v-SNARE são formadas e retornam às membranas dadoras

22. Mecanismo de fusão membranar Vesículas de neurotransmissores T-SNARE(Syntaxin e SNAP-25) V-SNARE(sinaptobrevina) Hipotético domínio membranar Modelo de interacção entre v e t-SNARE conduzindo à fusão membranar NSF promove o desenrolamento das SNAREs

23. LER Mecanismo de fusão membranar Vesículas de neurotransmissores A toxina do tétano e do botulismo actuam como proteases das SNAREs

24. LER HA1 (3) Fusão membranar Fusão do vírus influenza com células animais HA1 (3) A membrana de uma partícula viral, funde-se com a membrana do endossoma (que a envolve) No caso do vírus da influenza, o pH acídico do endossoma causa alterações conformacionais na glicoproteína de cobertura do vírus (HA-hemaglutinina), expondo péptidos de fusão muito hidrofóbicos, os quais são inseridos no interior da membrana das vesículas endocíticas A inserção de várias HA activadas, conduz à fusão do vírus com as membranas do endossoma, num processo conduzido por vários outros intermediários.

25. Fusão membranar Fusão do vírus influenza com células animais LER

26. Fusão membranar Fusão do vírus influenza com células animais LER

27. Fusão membranar Fusão do vírus influenza com células animais LER

28. LER Fusão membranar Fusão do vírus influenza com células animais

29. Exocitose Um dos percursos finais do transporte celular A libertação dos produtos de secreção (grânulos de secreção) requer fusão membranar (entre a membrana do grânulo e a membrana plasmática) A fusão das membranas cria uma abertura (poro de fusão) permitindo a libertação do conteúdo do grânulo para o espaço extracelular – exocitose. Este processo é desencadeado por um aumento local de Ca2+.

30. Exocitose A face luminal da membrana da vesícula integra-se na superfície externa da membrana plasmática A face citosólica da membrana da vesícula integra-se na superfície interna da membrana plasmática

31. Exocitose Modelo de fusão de membranas As proteínas de cada uma das membranas em fusão entram em contacto E formam um poro que pode dilatar-se As bicamadas de lípido das duas membranas fundem-se assim que as moléculas de lípido se difundem ao longo das superfícies hidrofóbicas criadas entre as proteínas (de fusão) que delimitam o poro de fusão

32. Lisossomas Possuem 50 ou mais enzimas hidrolíticas: fosfatases, nucleases, proteases, (colagenases), polissacaridases, enzimas lipolíticas,... Os produtos de baixo MW, resultantes da digestão podem ser transportados através da membrana lisossomal, para o citoplasma Todas as enzimas lisossomais são activas a pH acídico (4.6) -hidrolases acídicas. Este pH é mantido por H+-ATPase presente nas membranas A membrana é protegida do ataque proteolítico pois possui proteínas integrais acídicas e muito glicosiladas Organitos Digestivos

33. Lisossomas A função principal relaciona-se com a digestão de compostos vindos do meio extracelular – fagossomas. São os lisossomas das células fagocíticas os responsáveis pela inibição (baixo pH e espécies de oxigénio reactivas), de microrganismos ingeridos e sua posterior digestão Função na fertilização O acrossoma do espermatozóide contém enzimas lisossomais que vão digerir a superfície do óvulo e permitir a entrada do espermatozóide Remodelação dos organitos celulares, autofagia - autofagolisossomas Corpo residual – sem actividade de digestão Grânulos de lipofucsina – permanecem no citoplasma

34. Entrada de partículas e macromoléculas na célula • Entrada de material extracelular de dimensões e características que não permite a sua passagem através da membrana ou de transportadores membranares • Vesículas formadas por dobras ou invaginação da membrana • Fagocitose– partículas • Endocitose - fluidos, solutos dissolvidos ou macromoléculas em suspensão

35. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Fagocitose • Vesículas • 1-2 mm de diâmetro • Células específicas (células fagocíticas) • Entrada e posterior degradação das partículas num lisossoma

36. Entrada de partículas e macromoléculas na célula

37. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Fagocitose • Protecção • Células fagocíticas - macrófagos, neutrófilos • Organismos invasores, células danificadas, glóbulos vermelhos velhos • As partículas a serem fagocitadas são reconhecidas por receptores na superfície das células fagocíticas (macrófagos) • A fagocitose é facilitada pela cobertura da superfície da partícula a ingerir por opsoninas • Vesícula fagocítica funde posteriormente com um lisossoma

38. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Neutrófilo Levedura

39. Sistema Membranar Sistemas Membranares Citoplasmáticos: Estrutura, Função e Transporte Membranar - Endocitose -

40. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Endocitose • Vesículas • 0,1 a 0,2 mm de diâmetro • 1)Entrada não específica de fluidos extracelulares • - Qualquer molécula pequena ou grande, presente no • fluído entra na célula • - Em certos tipos de células pode servir para a • conversão de membrana plasmática (celular) em • membrana citoplasmática (RE)

41. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Endocitose • 2)Entrada específica de macromoléculas extracelulares e que se encontram em baixa concentração no fluído extracelular – mediada por receptores • - hormonas • - factores de crescimento • - enzimas • - proteínas do plasma • receptores localizados em “coated pits” de clatrina

42. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Via endocítica A via endocítica começa com a organização de uma rede de microtúbulos e vesículas – endossomas: - endossomas primários na periferia da célula - endossomas tardios , próximos do núcleo Distinguem-se de acordo com a sua densidade, pH e composição em proteínas (podem ser separados por centrifugação) . O material que entra por endocitose é transportado em vesículas endocíticas até aos endossomas primários, onde são redistribuídos. MPR-receptor da manose-6-fosfato

43. Entrada de partículas e macromoléculas na célula Via endocítica . Material dissolvido e ligandos, são transferidos para os endossomas tardios, em vesículas transportadoras específicas . Proteínas integrais das membranas das vesículas, ficam concentradas em compartimentos tubulares dos endossomas primários – centros de reciclagem. . As moléculas que atingem os endossomas tardios fundem-se posteriormente com lisossomas. a- maturação dos endossomas tardios em lisossomas b- fusão dos endossomas com lisossomas já existentes c- transporte por vesículas

44. Estrutura da Clatrina Organização estrutural da clatrina e adptador, das vesículas de endocitose Nas vesículas originadas no TGN o adaptador tem composição diferente mas muito semelhante

46. Receptors that use clathrin-coated vesicle endocytosis have unique peptide signal • Signal is: Phe-Arg-X-Tyr • This signal mediates adaptin binding • Adaptin in turn binds to individual clathrin molecules

47. a b c d Entrada de partículas e macromoléculas na célula Endocitose mediada por receptores Cobertura de Clatrina Vesículas Cobertas De Clatrina

48. Coat seen on inner side of cell membrane • This is EM evidence for the occurrence of RME • Similar for LDL, yolk protein uptake

49. Estrutura da Clatrina Composta por 3 cadeias leves e 3 cadeias pesadas Dispõem-se numa estrutura de 3 braços – Triskelion Esta estrutura permite construir diferentes organizações poligonais (hexágonos/pentágonos)

50. Papel das “coated pits” As vesículas endocíticas de clatrina necessitam para a sua formação de uma proteína adicional, uma proteina que liga GTP – Dinamina Esta proteína organiza-se em pequenas hélices que se dispõem em colar em torno da vesícula. Esta proteína estrutural é capaz de gerar forças mecânicas Análogo não hidrolisável