1 / 65

La Espectrometria de Masas en la Identificación de Proteinas

La Espectrometria de Masas en la Identificación de Proteinas. Dra. Irene Fernández Servicio de Espectrometria de Masas. UB. PROTEÒMICA. 1. Spot 2. Rentat Extracció 3. Digestió 4. Extracció. Gel. Proteïna. Barreja de Pèptids tríptics. Espectrometria de Masses. MALDI.

lacey
Download Presentation

La Espectrometria de Masas en la Identificación de Proteinas

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. La Espectrometria de Masas en la Identificación de Proteinas Dra. Irene Fernández Servicio de Espectrometria de Masas. UB.

  2. PROTEÒMICA 1. Spot 2. Rentat Extracció 3. Digestió 4. Extracció Gel Proteïna Barreja de Pèptids tríptics Espectrometria de Masses MALDI Electrospray Base de Dades

  3. ELIMINACIÓN - Colorantes ( sales de plata, Coomassie Blue, . . . ) - Urea (desnaturalitzación prot., detergentes ) - Agentes reductores ( DTT, DTE ) - Glicerol, agentes alquilantes, SDS

  4. Proteasas y posiciones de corte específicas EnzimaPosición de corte Trypsin/K-, /R-, \P Chymotrypsin /W-, /Y-, /F-, \P Glu C (V8) /E-, /D, \P Lys C /K-, \P Asp N /d- Proteína R K K R Trypsin K K K Mezcla de Péptidos trípticos R K

  5. Informació masses 15.200 Da Punts de digestió Modificació % MS NH2 COOH m/z Proteïna Digestió Enzimàtica ( Trypsina, V8) Química (CNBr, BNPS) Seqüència MS/MS NH2 MS 1025 COOH m/z 215 518 NH2 COOH Pèptids tríptics m/z 874 1025 1025 1448 BASE DE DADES

  6. Detección en el Masas

  7. % m/z 12C+14N+16O % 13C+14N+16O 12C+15N+16O 2x13C+14N+16O 13C+15N+16O m/z

  8. Monoisotopic Mass Monoisotopic Mass Monoisotopic Mass Average Mass

  9. FONTS D’IONITZACIÓ ELECTROSPRAY MALDI

  10. ELECTROSPRAY

  11. FONT ELECTROSPRAY LC/MS HPLC Introducció directa Ions : (M+nH)n+, (M-nH)n- analitzador

  12. Tripèptid Lys-Met-Asp (KMD) MW monoisotopic= 459.3 Da CH-(CH2)3-NH2 A H2N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOH CH-(CH2)3-NH2 + A1(M+H)+=460.3 H3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOH + CH-(CH2)3-NH3 + A2 (M+2H)2+= 461.3/2 = 230.6 H3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOH A2 A2 230.6 % A1 460.3 m/z

  13. ESMyoglobin20 femtomoles MWaverage=16.951.1 A18 A19 A20 Espectre real ESI A21 m/z A m1-H n = m2- m1 Deconvolució a l’escala real de masses m

  14. Barreja: human haemoglobin

  15. TIC

  16. MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

  17. Matriu( SA, CHCA, THAP, DHB) Mostra 1 mL Cristal.lització Concentracions: Peptids,proteïnes : 0.1 a 10pmol/mL Oligonucleòtids :10 a 100pmol/mL Laser hn Analitzador ( TOF, quadrupol) Ions (M+H)+ (M-H)- MALDI

  18. MALDI - Tècnica senzilla i ràpida. Fàcil preparació mostra. - Informació : . Pes Molecular. Fins 300KDa. Poca fragmentació . Anàlisi barreges sense separació prèvia ( digerits proteics ) . Seqüenciació : PSD, ISD, Enzimàtica (informació estructural ) . Proteïnes, pèptids, oligonucleòtids, oligosacàrids, . . . . - Quantitat de mostra : mL, conc. : <pmol - No quantitativa

  19. ADA 40394.3 20173.1 TRYPSINA Pèptids tríptics

  20. Daniel C. Liebler “ Introduction to Proteomics”. Humana Press, 2002

  21. Daniel C. Liebler “ Introduction to Proteomics”. Humana Press, 2002 Diapositiva 13 de 65

  22. Detector Detector

  23. Información masas Digestión NH2 MS COOH NH2 COOH NH2 Proteína COOH m/z 874 1025 1025 1448 MS/MS Péptidos trípticos m/z = 1025 p* A-L-R-S-C-D-K-R BASES DE DATOS m/z 215 518 725 Secuencia péptidos trípticos Proteína

  24. SEQÜÈNCIACIÓ EN MS - Maldi-TOF : PSD, ISD - Electrospray i Maldi-TOF/TOF: MS/MS - Comparació MS vs Seq. EDMAN . MS mesura masses. AA nous o modificats es poden detectar bé. . N-terminal no lliure no és problema . MS es pot fer directament sobre barreges senzilles . Adquisició rápida i no gasta reactius . Tamany de pèptids fins a 25 residus aprox. . L’informació a vegades no es complerta i alguns pèptids presenten dificultats . Quantitat : pmol de substància

  25. MALDI-TOF INFORMACIO ESTRUCTURAL (ISD) ( In Source Decay ) -La DM entre els diferents fragments ens informa de la seqüència Tant en proteínes com en DNA

  26. SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS Fragmentos iónicos H2N------aa1------aa2------aa3------COOH Roepstorff, P.; Fohlmann, J. Biomed.Mass Spectrom, 11, 601 (1984)

  27. NANOLC011_011009135104 # 781 RT: 51.94 AV: 1 NL: 5.24E5 F: + c d Full ms2 627.42@35.00 [ 160.00-1265.00] 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 Relative Abundance 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z Ejemplo espectro MS/MS Ión precursor doblemente cargado: 627.3 Mr = 1253.6 Da Secuencia: qCYFHQFLK • -Espectros complicados. • Programas secuenciación DE NOVO. • Introducción en las bases de datos. 672.1 434.8 535.1 1107.1 719.0 819.2 994.1 848.1 1108.1 407.0 994.9 271.7 518.1 536.0 435.8 1109.1 1080.1 849.2 654.2 983.2 343.8 581.9 482.6 259.9 282.9 618.5 736.2 176.4 966.3 389.0 1125.9 943.4 803.3 242.4 1011.9 315.7 1179.3 1213.6

  28. Secuenciación - PSD MALDI-TOF con REFLECTOR Linear Detector Fuente Reflector Detector Tof-Lineal Selección m/z= Reflector Laser Láser % Espectro m/z

  29. Fragmentación MS/MS - Analizadores en Tandem - Ion Trap Ionización Selección Fragmentación Lectura Fragmentos % Espectro fragmentos m/z

  30. Fragmentación MS/MS Fuente Analizador C.C. Analizador Ionización Selección Fragmentación Lectura Fragmentos Triple Quadrupolo QQQ Quadrupolo-TOF QTOF Sector Magnético Quadrupolo BQ TOF-TOF

  31. ESI/Q-TOF Fuente Quadrupolo TOF muestra Ionización CID (M+H)+n separación m/z separación m/z MS/MS

  32. A G C A

  33. A A C G Q

  34. A A C G Q A G C A

More Related