1 / 42

Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010

Soutenance de thèse. Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12. Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010.

khanh
Download Presentation

Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Soutenance de thèse Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12 Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010

  2. Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal

  3. Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] • Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? • Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? • Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? neurite cône de croissance noyau corps cellulaire (soma)

  4. Le cône de croissance : structure et fonctions faisceau de filaments d’actine chimio-attraction chimio-répulsion filament d’actine microtubule filopode lamellipode cône de croissance axone

  5. Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] • Adhésion cellulaire et différenciation neuronale : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? • Propriétés de surface des biomatériaux : • La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? • Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? • Propriétés de surface des biomatériaux : • La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? • Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? • Propriétés de surface des biomatériaux : • La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? • Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Deux paramètres : Nanorugosité Gradients locaux ΔE E2 E5 E4 Distribution de l’énergie de surface E3 E1 1 µm 1 µm ? surface

  6. Partie I Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la neuritogénèse

  7. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

  8. Technique de modification du verre

  9. Stratégies de modification du verre par diverses molécules PLL n EDA

  10. Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale • Les cellules PC12 : • sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. • voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencientsous traitement auNGF. • Les cellules PC12 : • sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. Cellule PC12 - 6 jours Cellules PC12 - à l’ensemencement Cellule PC12 NGF 6 jours

  11. Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF avecNGF sans NGF 6 jours 6 jours

  12. Neuritogénèse induite par effet de surface Sur PLL : Sur EDA : sans NGF sans NGF verre/EDA 6 jours 6 jours 6 jours Gradients locaux dans les énergies d’adhésion

  13. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

  14. Expression du marqueur neuronal : MAP1B

  15. Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture) verre/PLL sans NGF témoin négatif verre/PLLavec NGF témoin positif verre/EDA sans NGF

  16. Expression du marqueur neuronal : Tau actine Tau ADN PEDA :6 jours (sans NGF) avec NGF sans NGF PEDA : 6 jours 50 µm 50 µm 25 µm 50 µm

  17. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

  18. Influence de la nature des terminaisons Biopolymères (acides aminés) Alkylsiloxanes NH2 NH3+ PLL EDA CH3 NH2 PLO HTMS peu ou pasde neuritogénèse neuritogénèse élevée

  19. Microscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50) EDA PLL 10 µm HTMS PLO

  20. Conclusions • Neuritogénèse obtenue par effet de surface • Expression de marqueurs neuronaux • Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion  Reproduction de l’effet du NGF Limites • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques  Influence de facteurs externes

  21. Partie II Identification des paramètres de surfaces critiques à la réponse cellulaire

  22. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

  23. Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes très désordonnée hétérogénéité chimique accrue très ordonnée conformation all-trans partiellement ordonnée perte des liaisons latérales Classe 2 Classe 3 Classe 1

  24. État virtuel ωVis ωSFG ωIR État fondamental Techniques de caractérisation des surfaces modifiées • Spectroscopie vibrationnelle : • génération de fréquence somme (SFG) État vibrationnel excité substrat • Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : • modèle Owens-Wendt énergie d’adhésion solide-liquide composantes dispersive/apolaire composantes non-dispersive/polaire

  25. Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H)

  26. Spectres SFG des substrats dans la région C-H HTMSH(θ= 104°) OTS(θ= 110°) ODMS2(θ = 96°) ODMS1(θ = 77°) HTMSM(θ = 56°) OTS ; HTMSH : Formation d’une monocouche très ordonnée Classe 1 ODMS1 ; ODMS2 ;HTMSM : Formation d’une monocouche désordonnée Classe 2 & Classe 3

  27. État virtuel ωVis ωSFG ωIR État fondamental Techniques de caractérisation des surfaces modifiées • Spectroscopie vibrationnelle : • génération de fréquence somme (SFG) substrat État vibrationnel excité • Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : • modèle Owens-Wendt énergie d’adhésion solide-liquide composantes dispersive/apolaire composantes non-dispersive/polaire

  28. Estimation des énergies libres de surface Classe 1 (¤) : Distribution homogène de l’énergie (s≈ d ) Classe 2 (▲) : présence de gradients locaux dans les Eadhésion Classe 3 (#) :  hétérogénéitéschimiques accrues

  29. Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfaces après 48h de culture sans NGF classe 1 classe 2 classe 3 surface très ordonnée surface (dés)ordonnée surface très désordonnée pas d’adhésion  agrégats cellulaires flottant adhésion limitée  quelques neurites adhésion renforcée  forte croissance neuritique 200 µm 200 µm 200 µm Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher)

  30. Conclusions • Identification du facteur critique : •  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques • Eadhésion(classe 3) > Eadhésion(classe 2) : quelle est l’influence du γs ? • Identification du facteur critique : •  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques • Eadhésion(classe 3) > Eadhésion(classe 2) : quelle est l’influence du γs ?

  31. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

  32. Modification du verre par des aminosilanes Monométhoxy-silane Triméthoxy-silanes DETA PEDA ADMS APTMS EDA État désordonné Classe 2 État ordonné Classe ???

  33. Analyses des surfaces NH2 : théorie de Zisman Liquides tests • eda & peda : • très hétérogènes (Classe 3) • adms & aptms : • plus homogènes (Classe 2) • deta : ??? ADMS APTMS énergies critiquesγc EDA PEDA ± 2 mN m-1

  34. Analyses des surfaces NH2 : théorie de Owens – Wendt Liquides tests • eda & peda : • très hétérogènes (Classe 3) • adms & aptms : • plus homogènes (Classe 2) • deta : ??? ADMS APTMS énergies critiquesγc ± 2 mN m-1

  35. Cellules en culture sur les surfaces NH2/OH après 24h de culture sans NGF cas particulier du deta classe 2 classe 3 différenciation : ++++ différenciation : + classe 2

  36. Conclusions • La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. • L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. • Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, • et la différenciation n’est pas stimulée. • Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, • et la différenciation est fortement stimulée. • La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. • L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. • Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) :l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, • et la différenciation n’est pas stimulée. • Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, • et la différenciation est fortement stimulée. • La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. • L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. • Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, • et la différenciation n’est pas stimulée. • Sur des surfaces hétérogènes :l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, • et la différenciation est fortement stimulée.

  37. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse • Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

  38. AFM : cellules PC12 sur verre/EDA. 150 nm

  39. Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B. témoin [cytochalasine] = 5 µM

  40. Conclusion générale. • Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la différenciation neuronale •  Mise en évidence de l’impact de gradients locaux • Redéfinition des monocouches auto-assemblées en qualité de substrat d’adhésion selon la distribution des énergies de surfaces qu’elles exposent •  Classe 1 : très ordonnée • Classe 2 : relativement (dés)ordonnée • Classe 3 : très désordonnée • Nécessité de combiner SFG et Owens – Wendt •  Assignation des substrats élaborés aux classes définies • Mise en évidence de l’influence des hétérogénéités chimiques locales du substrat dans les processus d’adhésion et de différenciation neuronale des cellules PC12

  41. Perspectives • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+

  42. Conclusion générale. Distribution de l’énergie de surface Distribution de l’énergie de surface ?

More Related