제 6 장 rhBMP-2 의 생물학 및 임상적 적용

1. 제6장rhBMP-2의 생물학 및 임상적 적용

2. 1.BMP의 family •BMPs 는 골에서 정제된 골유도 추출물이 존재함을 근거로 발견함. •부분적인 단백질 분리과정을 거친후 molecular cloning을 이용하여 BMP의 유전자가 확인됨. •첫 번째 유전자의 DNA순서는 BMP-2에서 BMP-7 까지의 연관된 물질이 골추출물에 존재함을 나타냄. •아미노산 순서에 의해 BMPs는 TGF-β의 subgroup을 형성함 (그림 6-1) • BMPs는 보다 큰 전구체로 합성됨. 세포외 유출을 허가해주는 secretory leader sequence와 하나의 큰 propeptide domain active or mature part를 구성하는 100-130 amino acid residues 의 카르복시 말단부 (그림 6-2)

3. 2.BMP와 골유도(Osteoinduction) •진정한 골유도란? 기존의 골부위 ( orthotopic ) 가 아닌 이소성( ectopic ) 부위에서의 골형성능력. •일반적으로 골유도물질은 carrier matrix material 과 결합되는데, 이것은 식립부위에 BMP를 움직이지 않게 도와주며 골이 형성될 부위를 한정시켜줌. •조직학적 특성 골형성의 일련의 과정 1. 간엽세포가 매식체로 침윤 2. 간엽세포가 연골아세포로 분화 (그림 6-3) 3. 세포들이 증식하고 석회화 되며, 연골성 조직은 제거됨 4. 골형성 (rhBMP-2 가 다량 식립된 경우에는 일찍 일어남)

4. • Bone derived BMP를 포함하는 system 의 특징 rhBMP-2 주입후에는 5일만에 골이 관찰 rhBMP-2가 중간의 연골기를 거치지 않고 간엽에서 직접 골을 형성하는 막내골화를 유도한다는 것을 의미함. • BMP-2,4,5,6,7을 포함하여 몇 개의 다른 BMP molecules 은 Osteoinductive 함. :모두 유사한 과정에 의해 골을 유도함 • BMP는 dimeric proteins 이기 때문에, 다른 BMP polypeptide subunits을 가지는 heterodimer 가 형성될 수 있음. (어떤 heterodimeric molecules은 homodimeric form 보다 더 높은 활성을 가짐.) •어떤 종류의 BMP는 연골이나 골을 형성하지 않으며, 다수의 기능은 불확실함. (다른 결합조직의 형성에 관여할 것임.) 예) GDF5,GDF6/BMP-13 또는 GDF7/BMP-12의 매식시에 건과 인대를 닮은 치밀한 결합조직의 형성을 유도함.

5. 3.BMP의 세포활동 • BMP는 세포에 대해 특정한 분화기능을 갖는 유일한 폴리펩티드 성장인자임. 예) multipotential mesenchymal cell 에 대해 rhBMP-2를 적용시키는 경우에 제2형 교원질과 aggrecan 과 같은 연골아세포 표현형의 발현을 야기함. •BMP의 부가적인 작용 1. 골아세포성 세포들에 대한 화학주성작용이 보고됨. -> BMP 가 매식되는 부위로 세포들을 유도하는데 도움을 줌. 2. 세포분열을 촉진 ( 예, 일차성 두개골 유래 세포) but, BMP는 많은 세포에 대해 분열을 촉진시키지 않음 (진정한 성장인자와 구분되는 점)

6. 4.BMP와 배아발육 •BMP family 의 구성원 등은 embryonic body plan의 형성계획을 결정하는 signaling molcule 로써 중요한 역할을 함. •BMP 의 역할 중배엽 유도와 발달 초기의 형상화, 골격발달과 사지의 형상화 , 신장, 치아, 폐, 피부를 포함하는 장기계통의 영역 발달을 포함.

7. •포유류가 BMP family에 20개 이상의 유전자들을 가지는 반면, 초파리인 Drosophila(fruit fly) 는 단지 3개 만을 갖음. •이중 decapentaplegic(dpp) 은 포유류 유전자의 BMP-2/BMP-4 subfamily의 유사체(analogue)임. 1.close amino acid sequence homology와 2.gene structure 의 similarity를 볼때, • dpp 유전자는 배아발육 초기에 등-배의 분화를 도움. (dpp의 돌연변이는 ventralized embryos) •추가로 dpp는 imaginl disks의 형성, 사지의 외적형성 (limb outgrowth),내장을 포함한 기관구조의 형성에 관여함. •포유류의 BMP와 Drosophila dpp 의 Cross - functionality(교차-기능성) : 인간의 BMP-4 gene sequence dpp 돌연변이체를 구조(rescue) 하는 능력 recombinant DPP를 쥐의 이소성 매식체계에 매식한 경우 bone을 형성하는 능력

8. • Xenopus(개구리)에서 BMP는 중배엽 형성기동안 axis specification 에 관여함. : BMP-4 는 강력한 ventralizing factor임. • Dorsalizing factor인 다른 분자들은 BMP-4의 작용을 억제하는 것으로 보임. 예) Noggin 은 BMP-4와 결합하여 비활성화 시켜서 BMP-4가 활동하는 영역을 제한하고BMP-4 activity 의 gradient를 형성함. Chordin 은 BMP-4의 ventralizing activity를 억제함. noggin, sog와 동질성인 Drosophila protein 은 DPP의 ventralizing activity를 억제함. •이러한 억제성의 분자들이 성인 포유류에서 BMP의 작용을 조절하는 기능을 갖는지는 불확실.

9. 포유류의 발달과정에서의 BMP의 역할 : BMP의 삭제나 변이는 폭넓은 표현형의 다양성을 나타냄. • Bmp2 또는 Bmp4 genes 의 삭제는 embryonic lethality를 가져옴. •대부분의 Bmp4 null mice는 낭배형성시기에 죽음. • Bmp5 와 Gdf5 유전자들이 비활성화 되면 살아남기는 하지만 뚜렷한 골격의 결손을 나타냄. • Bmp5 genes 의 기능의 상실은 짧은 귀, 늑골의 결손, 연골성 구조물의 감소 •골격결손부위는 Normal embryos에서 BMP-5 mRNA expression이 관찰되는 부위와 관련있음 but, short-ear mice에서 embryonic expression의 다른 많은 부위는 영향을 받지 않는 것으로 보임. (다른 BMP molecules 이 특정부위의 BMP-5의 결여 를 기능적으로 대체함을 의미) • Gdf5 의 결여는 관절의 기형적 변형과 같은 brachy-podism을 나타냄. Gdf5 transcripts 가 발달과정에서 많은 관절부위에서 정상적으로 보이지만, 특정 관절만이 Gdf5 null mutant에서 발견되는 표현형을 나타냄.

10. • BMP는 다른 다양한 조직과 기관의 형성에 필요함 예) BMP-7 null mice 의 표현형은 정상적인 신장발달의 실패 ( 배아발육후기동안 BMP-7의 mRNA expression 의 중요한 부위) BMP-4 는 치아발달로 이어지는 중배엽과 상피의 상호작용시에 신호를 보내는 분자 BMP8b genes 의 붕괴는 정자생산의 결함을 나타냄.

11. 5.Bone repair를 위한 동물모델에 있어서 rhBMP-2의 연구 rhBMP-2 의 생산 •Recombinant protein(재조합 단백질)은 세포의 발현체계중 하나에서 생성됨. • rhBMP-2 는 포유류의 세포발현 체계를 이용하여 생산됨. • rhBMP-2- expression cell line을 생산. (BMP-2 coding sequence 나 cDNA 가 strong promotor 와 selective marker와 연결됨 -> 숙주세포내로 주입 -> selectable marker를 사용하여 coding sequence를 포함하는cell이 선택됨. -> cell line 생성됨) •생성된 cell line은 높은 수준의 protein을 expression 함.

12. rhBMP-2 의 안전성 •현재 rhBMP-2의 임상적 적용은 Absorbable collagen sponge(ACS)와 함께 매식 사용함. •한번 or 여러번 투여되는 정맥내 투약연구는 쥐와 beagle dogs에서 임상적 사용량을 훨씬 초과하여 사용 -> 부작용 관찰안됨. 약간의 연골형성 or 골형성이 주입부에서 관찰됨. ( 단백질의 약리학적 작용과 일치) 생식계, 임신이나 embryonic growth & development 에 영향 없음. •rhBMP-2/ACS의 잠재적인 국소적 독성 평가 방법: 6개월간 beagle dogs, 설치류의 하악과 악안면골결손부위 매식연구 결과 : 기대했던 매식재료의 국소적 골유도작용, 염증 없음, 전신적 독성없음.

13. • Chinese hamster ovary(CHO)를 숙주로 선택 • CHO는 포유류의 세포로 다양한 성장인자를 합성하므로 active BMP를 만들고 분비함. 이과정에서 precursor polypeptide chains 의 합성, 이 사슬들의 정확한 refolding 과 dimerization , 단백질의 glycosylation 등의 과정이 있음. (그림 6-4) •단백질은 세포를 나와서 조절된 배지로 배출됨. (이과정에서 propeptide 가 mature region으로부터 제거됨) •재조합단백질의 약학적 생산을 위해 rhBMP-2 cell line은 master cell bank에서 확장되고 동결됨. ( 점차 큰 부피의 성장배지로 비율을 늘린다) •세포는 걸려지고 제거되며, rhBMP-2는 배지에서 column chromatography 단계를 거쳐 98%이상의 순도로 정제됨. 최종 rhBMP-2 용액은 멸균후 동결건조됨.

14. •약리학적 연구와 흡수,분배, 대사, 배설 연구 -> rhBMP-2의 독성효과 결여를 뒷받침함. : 전신적으로 투약된 rhBMP-2는 재빨리 간과 망상내피계에서 제거됨. ( 약 1분의 distribution t1/2 와 약 7분의 elimination t1/2를 나타냄) • ACS 와 rhBMP-2를 매식한후 , rhBMP-2의 존재시간 : 매식부위의 형태, 혈류공급량 에 의존 •설치류에서의 동소성(orthotopic) or 이소성(ectopic) 매식 연구. 평균존재시간 : 3-7일 ( 매식부위로부터 rhBMP-2가 비교적 느리게 방출됨) 느린방출과 rhBMP-2의 빠른 전신제거율로 전신적으로 노출되는 비율을 매우 낮게함. ->연구결과 전신적으로 측정된 rhBMP-2의 최대량은 식립된 양의 0.1%임.

15. •어떤 생물학적 활성재료는 종양의 성장을 유도하거나 증진시킬 가능성을 높인다. •인간의 세포계에 대한 rhBMP-2의 영향 1.골육종을 포함한 모든 세포계에서 세포성장이나 세포성장의 억제에 대한 영향 없음. 2.alkaline phosphatase의 생성은 가끔 증가. 3.soft agar에서의 primary human tumor cell 의 종양형성능력 실험에서 rhBMP-2는 효과없거나 억제성임. 결론: rhBMP-2가 성장인자보다는 분화인자로 작용한다는 사실과 일치 종양세포의 성장을 돕기보다 종양세포를 분화시키는 것으로 예측됨.

16. 6.구강악안면 영역에서의 재건술에 대한 임상적 연구 • rhBMP-2와 같은 골유도단백질의 능력은 구강악안면 수술에 대한 다양한 임상적용이 가능함. 예) 외상이나 외과적 절제로 인한 골결손을 대체하는데 사용. 치과용 임플란트와 같은 보철적 수복을 위해 상/하악골의 증대가 시행됨. 치과용 임플란트 식립시에 Osseointegration 에 필요한 시간을 감소 시키거나 안정성을 증가시키위해 Osteoinductive protein을 적용 •치주질환에 이차적을 흡수된 골의 재생은 현재의 치료법으로는 불완전함. :이상적인 결과를 얻기 위해 bone formation 이외에 다른 tissue type 의 regeneration이 요구됨. (치주인대/ 백악질의 재형성을 포함한 치주부착기구의 재건)

17. 연구1 목적: 개에서 결손길이 3cm 의 전층 하악골 결손을 형성 -> rhBMP-2에 의한 골유도를 관찰. 탈회되어 추출된 개의 골기질과 poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA) microspheres, ACS를 포함하는 몇가지 기질재료와 혼합된 rhBMP-2를 사용하여 성공적인 재건이룸. 식립후 4주만에 결손부의 신생골형성이 명확히 관찰됨, 수개월에 걸쳐 방사선 밀도 증가

18. 연구2 0.005-2.0mg/mL 용량의 rhBMP-2 가 ACS 와 같이 실험. 초기의 하악골 안정성을 위해 사용되는 고정판은 rhBMP-2 처치후 8-10주만에 제거될수 있었음. 결론: rhBMP-2/ACS 에 의한 골재생은 임상/방사선학적으로 증명됨. 연구3 rhBMP-2/ACS 에 의한 골유도의 과정을 자세히 관찰하기 위해서 사용한 실험모델임. rhBMP-2/ACS의 식립후 3, 5, 10, 14, 21, 28일에 동물을 안락사. 조직학적 평가결과 임플란트 주변의 골형성이 5일만에 관찰됨 ( 그림 6-5a) 성공적인 경우) ACS 운반체가 제거되면서 임플란트 내부로 골형성이 계속됨. 이연구에서는 연골형성은 관찰되지 않았고, 오직 direct bone formation (막내골형성)만 관찰됨 ( 그림 6-5b) 이연구에서 연골중간기를 가지며 연골내골화과정을 통한 골과 막내골화 과정을 거치는 골모두에서 BMP의 형성유도능력이 입증됨. ->두가지 경로의 상대적인 분포를 결정하는 요인 (불명확) 1. 적용된 BMP의 용량 ( 많을수록 직접 골형성이 증가됨) 2. 식립위치와 그부위의 세포반응 3. 식립부위의 혈관밀도 4. 운반재료의 성질

19. 연구4 rhBMP-2/ACS 는 사람이외의 영장류에서도 큰 불연속성의 결손부를 회복함. 예) Macaca fasicularis 원숭이에서 2.2-3.0cm 의 하악골 결손을 0.2-0.8mg/ml 농도 사이의 rhBMP-2를 포함하는 rhBMP-2/ACS로 처치함. 임상적으로 새로 형성된 골은 식립후 5주가 지나면 손으로 만져질수 있음. 방사선밀도는 술후 6-8주에 명확히 관찰됨. 조직학적 분석은 결손부의 상부변연에서 특별히 발견되는 피질골 개조를 포함하는 결손부 전체에 걸친 골형성을 보여줌. 0.4-0.8mg/ml 농도의 rhBMP-2 적용은 0.2mg/ml를 적용하는 경우보다 형성된 골의 양과 분포 면에서 더 우수한 골형성을 나타냄.

20. 연구5 1)사람이외의 영장류 모델과 개의 하악골 결손부에서 rhBMP-2로 유도된 골내 치과용 임플란트를 위치시키는 능력을 보여줌. 2)사람이외의 영장류모델을 사용한 임플란트주위염에 의해 형성된 결손부에서 rhBMP-2에 의한 골재생과 골유착의 촉진이 증명됨. ( 그림 6-6 a , b) 결론 : rhBMP-2가 치주질환과 유사하게 골이 소실된 상황에서 골을 재생시키는 능력뿐 아니라, rhBMP-2/ACS 가 식립후 16주만에 골과 임플란트 사이의 접촉량 증가를 보임. 연구 6 치과영역에서 rhBMP-2가 골을 재생하는 능력이 있다는 것이 증명됨. 예) 개모델에서 5mm 깊이의 결손부는 rhBMP-2와 PLGA microspheres 와 자가혈액을 혼합한 것을 적용하여 회복시킴 , 치주인대와 백악질의 본질적 재생도 관찰됨. (rhBMP-2의 직접/간접적 효과에의함)

21. 8.경쟁적 치료 (Competing Therapies) •GTR(조직유도재생술)은 세포 차폐막을 사용하여 골재생을 허용하고 섬유조직의 ingrowth를 막는것. •재생은 결손부에 존재하는 세포들에 의존함. -> 재생되는 골의 양은 제한적임. •치주조직치유에서의 임상적 활용으로 비흡수성/흡수성 차폐막의 발달. •부가적인 외과적 술식이 결과에 많은 영향을 주고, 많은 경우에서 재생은 불완전하게 나타남.

22. •골재생(Bone regeneration)을 위해 많은 골이식재료가 사용됨 : 자가골 이식이 가장 성공적인 결과를 보임. •자가골 이식의 장점 1. bone-forming cells 제공 2. Osteoconductive properties ( new bone 의 deposition과 expansion을 허용하는 표면) 3. Osteoinductive components (BMPs) 의 제공. •자가골 이식의 단점 1. 골이식의 양이 제한적 2. 부가적인 외과적 술식이 필요함.

23. •여러 가지 형태의 동종골 이식(입자형, 피질골판 등)이 사용됨 장점: Osteoinductive qualities ( 재료의 물리적 성질에 의존) Osteoinductive activity 의 잠재력을 제공. 단점 : 처리과정에서 질환의 전달, 항원성의 위험. • DFDBA ( Demineralized freeze-dried bone allogrft ) 치주수술에 널리 사용됨. 골의 탈회는 BMP 요소들의 접근을 허용하여 골이식의 Osteoinductive qualities를 증가시킨다고 추정. 무기물과 탈회된 동종이식재료들의 동물연구에서 무기질 재료들은 흡수되는 반면 칼회된 재료들은 신생골 형성을 유도함. ( Contravacy 함) 다른 의견: DFDBA 가 치주적 재생에서 임상적 성공이 BMP의 결과인지, 단지 골전도성인지는 불명확함. • DFDBA 의 원료와 처리기술에 의해 골유도능력의 양은 다양함. 예) 6개의 다른 골은행에서 무작위로 고른 DFDBA의 표본 14개를 1-2개월 동안 쥐의 피하와 근육내에 매식 결과 : 피하에 위치시켰을 때에는 신생골은 어떤 쥐에서도 나타나지 않음. 근육내 매식부위에서 3개의 골은행에서의 표본에서 골이 생겼고, 한개의 골은행에서 골유도가 나타나지 않음.

24. • DFDBA에서 유용한 BMP의 양은 적다. 설치류에서보다 영장류에서 골을 형성하는데 대단히 많은 BMP의 양이 필수적임. DFDBA가 환자에서 실제로 골유도를 타나내는지는 비관적. •다른 골성장인자와 호르몬을 사용한 임상적 시험. (골세포에서 TGF-β가 골기질에 많이 존재하기 때문에 효과에 대한 광험위한 연구시행됨. ) 1.TGF-β는 골아세포에 의해 골기질 형성을 증가시킴. 실험) 설치류에 TGF-β를 골에 인접하여 주사할 경우 골형성을 자극함. 2.Ostoid의 광물화(mineralization)을 방해 3.섬유화와 면역억제 효과 • BMP가 TGF-β의 superfamily 에 있지만 서로 다른 수용기에 붙어서 다른 기능을 수행함. 예) rhBMP-2는 많은 cell type에서 osteocalcin production을 자극 ( 분화된 골아세포의 marker) TGF-β는 이러한 protein 의 expression을 억제. • TGF-β가 bone에 매식체의 고정을 증가시킨다는 임상전 연구가 있음.

25. • Insulin-like growth factors 는 bone cells 에 의해 생성된 폴리펩타이드 이며 , 골기질에 존재함. 1.골아세포계열의 세포증식을 자극 2.differentiated function을 증가시킴 ( collagen matrix secretion) •또 다른 세포분열 유도인자 PDGF (혈소판 유래 성장인자) : 골기질과 창상 치유환경에서 나타나는 혈병에의해 나타남. IGF와 PDGF 는 어떤 세포유형에서 상승효과를 보임. PDGF 와 IGF or PDGF 와 dexamethasone 의 복합치료 -> 치주조직의 치유의 임상전 연구에서 기대되는 결과를 얻음.

26. 9.rhBMP-2의 임상연구 •BMP-2 와 BMP-7(OP-1)에 대한 정형외과적 연구와 구강외과 영역에서 몇 개의 운반체와 관련된 연구. •BMP-2의 초기연구 목적: 1. BMP-2가 포함된 매식체 재료의 준비 용이성. 2. 매식체 식립의 용이성 ( 매식체의 안정성 확립) 결론: 골을 형성하는 rhBMP-2 의 능력에 대한 정보를 모음. (다른 부분에서 )

27. 연구1 목적: 상악동저의 증대를 유도하는 rhBMP-2/ACS 의 능력을 시험. 상악구치부의 골의양이 임플란트를 식립하는데 불충분한 상태. 한가지 농도 (0.43mg/ml) 의 rhBMP-2가 12명의 환자에서 ACS와 함께 시험됨. 일차적 목적:1. rhBMP-2의 국소적/전신적인 안전성, 2. 매식체의 조작능력 3. 골유도를 측정하는 가장 좋은 수단을 확인하기 위함. ( 치근단 방사선 사진 or 컴퓨터단층촬영) 결과 : rhBMP-2/ACS 재료는 쉽게 매식됨 ( 우수한 조작점수 ) serum chemistry 또는 hematology parameter 의 변화없음. ->어떤 환자도 rhBMP-2에 대한 항체가 발견안됨 : 한 환자에서 low-titer anti-bovine collagen Ab 가 나타났으나, anti-human collagen Ab는 아님. 매식 16주후, 12명의 모든 환자는 상악동안에 방사선밀도로 골형성의 증가를 확인

28. 연구 2 새로운 골의 생검 표본을 얻음 , ( 16주의 골유도후 여러기간에 얻어짐. ) 골내 치과용 임플란트가 위치함. 새로운 골소주 (trabecular bone ) 형성이 상악 피질골 형성에 앞선다. (그림 8a) 새로운 골은 많은 활동성 표면을 가지고 있고, Osteoblast가 명백히 침착된 Osteoid 와 정상과 같은 골수요소를 가짐. (그림8b) 골소주의 두께와 층판골의 상대적 양의 증가가 있음. 어떤 표본에도 ACS 는 관찰안됨. 결과 rhBMP-2/ACS가 재형성 되는 골을 유도함으로 매식부와 결합한다.

29. 연구 3 목적: 치조제 보존 or 증진을 위해 rhBMP-2/ACS 의 사용 가능성을 조사하기 위한 연구 rhBMP-2/ACS 는 발치후 발치와에 적용하였을 때 골의 재형성이 신속히 일어남. 상악동기저부 증대를 포함하는 몇몇의 치조제 증대술과성에서 다양한 농도의 rhBMP-2가 ACS와 결합되어 관찰됨.

30. AVN ( avascular necrosis )의 한가지 치료법 -> core decompression • subtrochanteric region에서부터 실활골까지 뻗어있는 뼈의 중심속을 제거하여 재혈관화를 자극하는 것. •이 중심속 부위에 rhBMP-2를 위치시키면 신생 골형성과 신생 혈관생상, 괴사조직의 생활골로의 대체 결과를 얻음. 1. 혈행의 촉진에 의한 신생골형성 2. sclerotic bone의 제거를 돕고, 생활골로 대체시킴 AVN 환자를 1.무작위로 core decompression만 시행. 2.core decompression 과 자가혈액으로 형성된 0.1mg/mL 의 rhBMP-2를 이식. :rhBMP-2와 blood mixture(10mL)는 생체밖에서 2시간 동안 응고, core defect에 위치, 피질골 plug와 bone wax로 봉해짐

31. •평가수단: 자기공명영상(MRI)를 사용하여 AVN의 범위와 부피 심각성을 결정. 수술전, core compression 후 4, 10, 16주 후에 얻어짐 •치료군과 대조군이 비슷한 비율로 core volume의 감소를 보임. •rhBMP-2/Blood 로 치료받은 군은 16주후에 괴사부위 부피가 34% 감소 대조군에서는 28% 증가. •결과 : 괴사 부위에서의 rhBMP-2의 효과를 확실히 제시함. rhBMP-2/blood를 받은 환자는 core decompression을 시작한 부위부터 이소성(heterotopic) 골형성의 증거를 보임 ->1.혈액이 rhBMP-2의 이상적인 운반 시스템이 아님 2. 외과적 술식이 rhBMP-2가 위치된 부위를 적절히 폐쇄하지 못함. 그러므로 : rhBMP-2를 특정 부위에 국소화 시킬수 있는 운반체계와 연계되어 core decompression에 보조적으로 사용될때 , 골치유가 가속화 됨.

32. 10. 결론 BMP 는 •세포분화, 증식, 형태분화와 같은 세포과정을 조절하는 단백질 인자의 모임. •배아체 형성기 동안 몸 부위를 결정, 많은 조직과 기관계의 발달을 조절함. • rhBMP-2와 같은 몇몇 BMP가 다양한 영역에서 골유도성을 보임. • rhBMP-2/ACS 복합체는 골형성유도능력을 보였음. ( 임상전 단계의 동물연구에서 골결손부를 치유함.)

33. 6-1 골에서 추출된 골유도물질로 알려진 골형태형성 단백질 분자간의 아미노산 배열 관계와 함께 TGF-β superfamily의 다른 구성원도 보이고있음. 이 그림은 Genetic Computer Croup 소프트웨어 프로그램인 PileUp을 이용 하여 제작. 첫 보존된 cysteine으로부터의 아미노 배열을 이용해 carboxy 말단에서 사람 분자의 성숙된 부분을 남김.  수평길이는 단백질이나 단백질 그룹간의 차이와 동일. (짧은 선은 아미노산 배열이 더 근접한 관계라는 의미: BMP-2와 BMP-4는 아미노산 차이가 별로 없는 반면 BMP-2와 TGF-β는 많은 차이가 있음.)

34. 6-2 TGF-β superfamily 구성원간의 아미노산 배열관계. 표시 되지 않은 것은 모두 사람의 배열이다. 그림2는 그림1에서 기인한 것 임. BMP (Bone Morphogenetic protein), GDF( growth and differentiation factor)

35. 6-3 연골내 골화를 보이기 위한 rhBMP-2/ACS 체외 매식의 조직학적 단면. 미분화간엽세포, chondrocyte, hypertrophic chondrocyte , osteoblasts 의 존재

36. 6-4 BMP-2 의 합성과정

37. 6-5a rhBMP-2/ACS 를 하악 견치 결손부에 이식하고 10일 후에 형성된 골의 조직학적 단면 직접골형성이 매식체 주변에 형성됨을 보임 6-5b 고배율 사진 매식체에 많은 혈관 있음. 활성 골아세포가 유골을 기저에 깔고 있는 상태가 관찰됨. 일부 골의 광물화 보임

38. 6-6b 원숭이에서의 임플란트 주위 염증 상태의 조직학적 단면 A)buffer/ACS 로 매식된 부위 B)rhBMP-2/ACS 로 매식된 부위 화살표) 골간의 접합부와 새로운 골의 형성 • 6-6a • 사람이 아닌 영장류에서 • rhBMP-2/ACS 에 의한 임플란트 주위염의 회복 • A)임플란트 주위 염증을 형성한 상태에서의 골소실 • B)rhBMP-2/ACS 를 위치시킴. • C)매식 16주 후 골개조 상태

39. 6-8b 고배율 현미경 사진 rhBMP-2/ACS로 유도된 골이 교직골에서 층판골로 개조됨 6-8a rhBMP-2/ACS가 매식된 환자의 상악에서 채취된 core biopsy specimen의 조직학적 단면 (매식 28주후 임플란트를 위치시킬때 얻음) 새로운 골과 예전의 골간의 융합에 주목