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Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica. www.bioinfo.ufrj.br/proteoma/. Proteoma ou Proteômica Definição:

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  1. Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica www.bioinfo.ufrj.br/proteoma/

  2. Proteoma ou Proteômica Definição: Análise simultânea de misturas complexas de proteínas como extratos de lisados celulares ou de tecidos, assim como fluidos biológicos, visando a identificação e/ou medir as mudanças do nível de expressão de proteínas em diferentes condições fisiológicas e/ou patológicas. Conjunto das proteínas expressas por uma célula é bastante dinâmico e dependerá das condições particulares/ ou do momento fisio/patológico da mesma.

  3. Aplicações: • Descoberta de novas drogas, • Estudos em patologia, • - Diagnóstico, • Terapias, • Microbiologia, • Bioquímica, • Fisiologia de plantas, • Controle de qualidade.

  4. Esquema geral de identificação de proteínas

  5. A Genômica possibilitou o sequenciamento de alta performance de diferentes gens de diversos organismos. Porém não resolveu questões importantes relativo á função de várias proteínas. “Podemos ver o Genoma como a descoberta dos hieróglifos que ainda necessitam ser decifrados” Genômica x Proteômica

  6. Histórico do sequenciamento de genomas 1977- bacteriófago phi-x174 (5386bp) foi 1. organismo sequenciado. Sanger et al [Nature246, 687 (1977)]. 1982- bacteriophage lambda (48,502bp) Sanger et al [J. Mol. Biol.162, 729 (1982)] anos 80 - genoma mitocondrial, 16kb; Epstein Barr virus, 172kb; human cytomegalovirus, 229kb 1980’s- final: desenvolvimento de sequenciadores automáticos 1991-menos de 2,000 gens de proteinas humanas conhecidos 1995- 1o. genoma de um organismo de vida livre 1995 bactériaHaemophilus influenzae Rd KW20- 1,8 Mbases

  7. 2004 – 160 genomas bacterianos completos, de 130 espécies 19 genomas de archae completos 28 genomas de eucariotos, completos, ou alguns cromossomas completos cromossomas completos, incluindo: • homem • camundongo (rato sendo sequenciado) • 3 plantas: Arabidopsis thaliana e 2 variedades de arroz • 2 peixes • 6 protozoários • 3 artrópodos incluindo Drosophila melanogaster • 6 fungos • nematódios, alga, cryptomonas

  8. Dados sobre composição do genoma: grande extensão de introns x exons Gen humano típico: 5 ou 6 introns, tamanho médio dos introns: 2100bp (alguns com 100000 bp) tamanho médio dos exons: 125bp Exons de gens celulares: 5% genoma humano

  9. Dados sobre composição do genoma: tamanho e número de gens Homem: 30.000 gens 2,8 x 109 bp Arroz (Oryza sativa): 20.000 gens 3,7 x 108 bp Drosophila melanogaster:13.600 gens 1,8 x 108 bp Escherichia coli: 5.300 gens 4,6 x 106 bp Comparando Homem e E. coli tem-se que: número de gens: 5,7x tamanho do DNA: 610 x

  10. Um gen  vários produtos ! questão 1: 1 transcrito primário podendo corresponder a mais de um mRNA, e portanto mais de uma proteina questão 2: 1 mRNA não sendo eficientemente traduzido, como ocorre em alguns casos de transferência lateral questão 3: alguns RNAs ficam longo tempo sem ser traduzidos em células eucarióticas questão 4: processamento pós-traducional: várias proteinas, com atividade distinta, vindo do mesmo gen

  11. Pos-Genômica Genomica Estrutural Proteômica Genomica Funcional DNA-Microarray Gel Electroforese 2D Espectrometria de Massa Sequenciamento de Proteina Crystallografia de X Ray NMR Sequência - Forma - Função

  12. Rede Proteômica Problemas Biológicos Gel 2D Gel 2D Cromatografia Gel 2D Gel 2D Bioinformatica Maldi - Tof Maldi - Tof MS-MS: ESI-Q-Tof MALDI TOF-TOF Microarray Expressão Cristalização Purificação de Proteína X- rays NMR

  13. Proteômica de Expressão Expressão Diferencial Proteômica Funcional Interação Proteina-Proteina Vias de Sinalização Modificação Pós- traducional Proteômica Quantitativa Abordagens em Proteômica

  14. UFP UFP UFP UFP UFP UFP UFP UEM-MALDI-TOF UEM-MS-MS UEM-MALDI-TOF Bioinformática UNIDADES DE EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CRISTALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS IDENTIFICAÇÃO

  15. Unidades de Fracionamento e Identificação 1) Departamento de Bioquímica Médica - ICB-UFRJ - Russolina Benedeta Zingali 2) Unidade Multidisciplinar de Genômica - IBCCF - UFRJ - Paulo Mascarello Bisch 3) Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ - Gilberto Domont 4) Instituto Oswaldo Cruz / FIOCRUZ - Jonas Perales 5) Universidade Norte Fluminense - Elias W. Alves Laboratorios Associados 1) Unidade de Apoio em Espectrometria de Massa - Departamento de Física - PUC/RJ - Enio Frota da Silveira 2) Unidade de Apoio de Genômica Estrutural - Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas - ICB/UFRJ - Jerson Lima Silva 3) Laboratório Associado - Agrobiologia - EMBRAPA - RJ - José Ivo Baldani

  16. PROJECTOS : 1. Proteômica de toxinas animais : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

  17. Objetivo: caracterização das proteínas presentes no veneno para identificação de novos princípios ativos. Metodologia: separação por 2-D identificação de proteínas por Mapa peptídico e por sequenciamento TOF-TOF Bothrops insularis snake venom proteins identified by peptide mass fingerprinting after 2D SDS-PAGE

  18. (Busca a partir dos dados da biblioteca de cDNA e ESTs do Dr. Paulo Lee Ho´s) kDa 94,0- 67,0- 43,0- 30,0- 20.1 - 14.4 - 494 detected spots

  19. Spot 394 PLA2 Spot 433, 427, 429 Lectin Spot 459 Lectin Spot 489 Lectin Spot 434 Lectin like c-type GEL MASTER Bothrops insularis

  20. Spot 489 Lectin

  21. Spot 24, 28, 29, 30, 31, 32, 77, 90, 93 and 96 Metalloproteinase (PIII) B.insularis kDa 4 7 94,0- Spots 255, 260, 261, 262 and 268 Metalloproteinase (PI) B.insuaris 67,0- Spot 258 Serine proteinase B. insularis 43,0- Spot 386 and 394 Phospholipase A2 B. insularis 30,0- Spot 356 Metalloproteinase (Agkistrodon contortrix laticinctus) 20.1- Spot 412 Anticoagulant protein A [Deinagkistrodon acutus] Spot 428 Convulxin beta [Crotalus durissus] 14.4- Spot 444 Unnamed Protein Product (Mus Musculus) Spot 474 Vascular endothelial growth factor 433 e 434 Agkisacutacin B chain [Deinagkistrodon acutus] 489 BJcuL precursor [B. jararacussu]. Spot 375, 435 e 459 Platelet glycoprotein Ib-binding protein alpha subunit [B. jararaca] Spot 427, 429 e 467 Lectin [Bitis arietans]

  22. A eletrofores bidimensional separa proteínas entre 10 kDa e 200 kDa: Proteínas maiores ou menores não são detectadas; Para análise de peptídeos dependendo da amostra podemos analisar diretamente no MALDI-TOF, ou ainda fazer uma separação prévia e analisar frações cromatográficas contendo peptídeos. Análise de Peptídeos: Peptidomics

  23. B. insularis crude venom MALDI-TOF/MS

  24. Lachesis muta MS/MS 1373 P G H I / L P P Crude venom direct analysis in MALDI-TOF qkpwppghipp Peptídeo potenciador de bradicinina

  25. PROJECTS : 1. Proteomics of animal toxins : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Proteoma de Expressão deVibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

  26. Proteomics. 2004 May;4(5):1491-504.

  27. Adherence of Vibrio cholerae El Tor to cell monolayers.

  28. 2D-gel, V. cholerae El Tor N16961 strain

  29. Experimental and predicted proteins for V. cholerae El Tor Total number of proteins predicted:………3820 In the pI range 4-7 and MW 10-110kDa:…2005 Spots found: ………………………………….539 Coverage in the range: ……………………26.9%

  30. Mapa de referência de Vibrio cholerae El Tor com 94 spots

  31. Isoformas: a mesma proteina em spots diferentes

  32. Identification of spots by peptide mass fingerprint: 94 spots, corresponding to 80 proteins

  33. Hypothetical and conserved hypothetical proteins identified as abundant proteins

  34. Estudo de gens hipotéticos e hipotéticos conservados: Uma vez identificados a partir de gel, deixam de ser hipotéticos São proteínas abundantes na célula, provavelmente importantes

  35. Metodologia básica para estudo de gens hipotéticos (ou outros que desejar) • Inativação do gen por mutação dirigida, e estudo do fenótipo; • Verificação da presença de anticorpos em soro de ex-pacientes de cólera; • Superexpressão da proteína, estudo de estrutura.

  36. PROJECTS : 1. Proteomics of animal toxins : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteoma da infecção viral (virus da dengue): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

  37. Dengue virus Crio-microscopy Replication cycle membrana:proteína E proteína M capsídeo:proteína C RNA fita simples positiva

  38. Clinical manifestations Assymptomatichemorragic fever / shock sindrome (DHF/DSS) DHF in Americas

  39. Effect of DEN infection in liver cells HepG2 cells - human hepatoma cell line Lima, C.S. ; Leão, S.C.L. and Da Poian, A.T. Dept. Bioquímica Médica, ICB, UFRJ

  40. OBJETIVOS • Identificação da modificação do padrão de expressão de proteínas durante a infecção pelo virus da dengue; (Depto Bioq. Med. Instituto Biof.) 2. Identificar as proteínas/ peptídeos secretados pelas células HepG2 em cultura durante a infecção viral. • (Depto Bioq.Med.) 3. Analisar os soros de pacientes com Dengue grave comparado ao soro de pacientes normais. • (Fiocruz) 4. Identificar marcadores para diagnostico além de novos alvos terapeuticos para o desenvolvimento de drogas antivirais.

  41. 1a. Parte estabelecimento de protocolo de replicação do virus da Dengue 2 em diferentes tipos celulares Célula escolhida Hep G2 (hepática) Com 2 dias de infecção.

  42. 2 days Estabelecimento do protocolo para análise do extrato celular 2D-electrophoresis cellular extracts (intracellular RNAs and proteins) control and infected cells mass spectrometry

  43. Proteome of HepG2 cells infected by DEN2 control cells infected cells (2 days) 116 66  45  29 20   4.0 7.0 4.0 7.0

  44. 6 hr or 20 hrs Estabelecimento do protocolo para análise das proteínas secretadas 2D-electrophoresis (proteins) concentration (secreted proteins) mass spectrometry control and infected cells 2 days culture medium (secreted proteins)

  45. Proteoma do secretado protéico das células (20 hrs) analisado por eletroforese 2D HepG2 infected cells secreted proteins HepG2 control cells secreted proteins

  46. Análise de Peptídeos e identificação PEPTIDOMICS

  47. ultrafiltration (peptides) 2D-electrophoresis (proteins) concentration (secreted proteins) mass spectrometry control and infected cells 2 days culture medium (secreted proteins) 20 hrs RP HPLC Concentration by lyophilization

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