CHAPTER 10 T-Cell Maturation, Activation, and Differentiation

1. CHAPTER 10 T-Cell Maturation, Activation, and Differentiation

2. Contents ▪ T-cell maturation and the thymus ▪ Thymic selection of the T-cell repertoire ▪ TH-cell activation ▪ TH-differentiation ▪ Cell death and T-cell population ▪ Peripheral γδT-cells

3. Development of T cells from hematopoietic stem cells on bone marrow stromal cells expressing the Notch ligand Fetal thymic organ culture J.C. Zuniga-Pfluker et al., Nature reviews Immonology, 2002 Notch KO mouse: failure to T cell maturation Notch transgenic mouse/HSCs: Only T cell maturation/No B cell maturation

4. Development of αβ T cells in the mouse 마우스에서의 αβ T세포의 발달을 나타낸 것이다. T 세포 전구체들은 골수 (bone marrow) 에서부터 혈류를 통해 흉선 (thymus) 으로 이동되고, 성숙 T 세포로 발달하게 된다. 성숙 T 세포는 말초 면역조직으로 이동하며, 항원-유도 활성화후에는 효과 세포와 기억 세포들로 분화된다. T 세포 발달의 각 단계는 stage-specific intracellular events 및 특이적인 세포-표면 marker에 의해 특징지어 질 수 있다. • DN: Double Negative • C-kit: stem cell growth factor receptor • CD44: cell adhesion molecule • CD25: IL-2 receptor의 α chain

5. DN2: TCR γ, δ,  gene rearrangement 개시 DN3: T cell의 증식은 중단 DN4: β chain gene rearrangement 후 DP가 증식을 멈추고 : RAG-1, RAG-2 level이 증가할 때 100% T-cell precursor에서 2%정도만 single positive T cells MatureT cells의 < 5%

6. Time course of appearance of γδthymocytes and αβ thymocytes during mouse fetal mouse development

7. Structure and activity of the pre-T cell receptor (pre-TCR) • 대부분의 이중 음성 흉선 세포들은αβ 발달 경로를 진행한다. 이들은 증식을 중단하고 TCR β 사슬 유전자의 재배열을 시작하며, 이어서 β 사슬을 발현한다. 생산적인 재배열과 β 사슬의 발현에 실패한 αβ 계열의 세포들은 죽게 된다. 새로 합성된 β 사슬들은 pre-Tα 사슬로 알려져 있는 33 KDa 의 당단백질과 결합하고 CD3그룹과 결합되어 pre-T 세포 수용체 혹은 pre-TCR로 불리는 하나의 새로운 복합체를 형성한다. 한 세포가 생산적인 TCR β 사슬의 재배열을 이루어 내고 신호를 주어서 좀더 나아가 증식 및 성숙이 일어남을 나타낸다. • TCR β 사슬 유전자들의 재배열이 더 일어나는 것을 억제하는 • 결과로 대립 유전자 배제가 일어난다. • T 세포에서 TCRα 사슬의 재배열이 허용되도록 한다. • CD4+ 이중 양성 상태로의 발달을 유도한다. ►a cell has made a productive TCR β-chain rearrangement and signals its further proliferation and maturation ►suppresses further rearrangement of TCR β-chain genes, resulting in allelic exclusion ►renders the cell permissive for rearrangement of the TCR α chain ►induces developmental progression to the CD4+8+ double-positive state

8. Thymic selection of the T-cell repertoire Thymocytes undergo two selection processes in the thymus: ►Positive selection → MHC restriction ►Negative selection → self-tolerance • TCR 배선 DNA 내부 무작위적인 유전자 재배열이 접합부위 다양성 (junctional diversity )과 연합하여 엄청난 수의 TCR 레퍼토리를 생성할 수 있는데 αβ 수용체에 대해서는 1015 , γδ 수용체에 대해서는 1018 을 넘어서는 잠정적인 다양성을 가지는 것으로 평가된다. • 흉선 세포들은 흉선 내에서 두 가지의 선택과정을 겪는다. • 자기-MHC 분자들과 결합할 수 있는 수용체를 가진 흉선 세포들에 대한 양성 선택의 결과 MHC 제한이 형성된다. 양성 선택에 실패한 세포들은 흉선 내에서 세포자살에 의해 제거된다. • 단독의 자기-MHC 분자들 또는 자기-MHC 에 의해 제시되는 자기 항원에 대해 강한 친화력을 나타내는 수용체를 가진 흉선 세포들은 음성선택에 의해 제거되어지는 결과, 자기관용이 형성된다.

9. Experimental demonstration that the thymus selects for maturation only those T cells whose T-cell receptors recognize antigen presented on target cells with the haplotype of thymus 다음 슬라이드에 설명..

10. Experimental demonstration that the thymus selects for maturation only those T cells whose T-cell receptors recognize antigen presented on target cells with the haplotype of thymus T 세포 생성에서의 선택에 대한 흉선의 역할에 대한 초기의 증거는 R.M. Zinkermapel 과 그의 연구원들에 의해서 수행된 키메라 마우스 실험에서 얻어졌다. 이들 연구자들은 흉선 적출과 방사선 조사를 행한 (A*B)F1 마우스들에게 B타입의 흉선 을 이식하였고, 그 후 F1 골수 세포들은 정맥주사로 주입하여 동물의 면역계를 재구성시켰다. 이식되는 흉선 에 어떠한 성숙 T세포들도 결합되지 않도록 하기 위해서 이식 전에 X선을 조사하였다. 이러한 실험에서 (A*B) F1 골수 이식 체 유래의 T세포 전구체들은 그 기관 세포들 상에 단지 B-일배체형 MHC 분자들만을 발현하는 흉선 내에서 성숙하게 된다. 이들 (A*B)F1 T세포들이 흉선 의 일배체형에 의해 MHC 제한이 될까? 이 질문에 답하기 위해 키메라 마우스를 LCM 바이러스로 감염시키고 이어서 미성숙 T세포들이 Strain A 또는 Strain B 마우스 유래의 LCM 바이러스에 감염된 표리 세포들을 대상으로 테스트 했을 때 이들은 오로지 Strain B 마우스유래의 LCM-감염 표적 세포들만 용해 시킬 수 있었다. 이들 마우스는 이식된 흉선 과 동일한 일배체형 중 B를 가지고 있다. 따라서 T세포들이 발달되고 흉선 의 MHC 일배체형이 그들의 MKHC 제한을 결정한다.

11. Positive and negative selection of thymocytes in the thymus ►thymic stromal cells: epithelial cells dendritic cells macrophages ►mature T cells are both self-MHC- restricted and self tolerant 다음 슬라이드에 설명…

12. Positive and negative selection of thymocytes in the thymus 양성 선택은 흉선 의 피질 부위에서 일어나며 미성숙 흉선 세포들의 피질 상피 세포들과의 상호작용을 포함한다. 세포-세포간의 접촉 부위들에서 흉선 세포들 상의 T세포 수용체들이 피질 세포들 상의 MHC 분자들과 결집해 cluster를 형성하는 결합이 있음이 그 증거이다. MHC 분자들과 결합할 수 없는 수용체들을 가진 세포들은 흉선 상피 세포들과 상호작용이 일어나지 않으며, 결과적으로 방어신호를 받을 수 없어서 세포자살에 의해 죽게 된다. 양성선택에서 살아남은 MHC가 제한된 흉선 세포들은, 자기-MHC 분자들에 의해 제시되는 자기항원에 대한 저 친화성 수용체들 (low- affinity receptor)을 발현하고 세포들과 고 친화성 수용체들을 발현하는 세포들을 포함한다. 후자의 흉선 세포들은 흉선 을 가진 세포들과의 상호작용에 의해서 음성선택을 겪는다. 음성선택동안 Class I 및 Class II MHC 분자들은 자신 수지상 세포들과 대식세포들을 자기 항원-자기-MHC 분자들 혹은 단독의 자기-MHC 분자들에 대한 고 친화성 수용체들과 상호 작용한다. 음성선택을 경험한 세포들은 세포자살에 의해 사멸되는 것으로 관찰된다. 그러므로 흉선 에 서 만나게 되는 자가-항원에 대한 관용을 이런 항원들에 반응하는 T세포들을 제거함으로써 성취된다.

13. 흉선세포들이 class Ⅰ 또는 Ⅱ 분자들에 결합하는 것이 흉선에서의 양성 선택에 필요하다는 것을 뒷받침하는 직접적인 증거는, 기능적인 class Ⅰ 혹은 Ⅱ 분자를 생성할 수 없는 knockout 마우스를 이용한 실험연구를 통해 얻어졌다. Class Ⅰ-결손 마우스는 정상적으로 분포하는 이중 음성, 이중 양성 및 CD4+흉선세포들은 가졌지만, 그러나 CD8+흉선세포들은 생성하는데는 실패하였다. Class Ⅱ-결손 마우스는 이중 음성, 이중 양성 및 CD8+흉선세포들은 가졌지만 CD4+흉선세포들은 가지지 않았다. 이러한 class Ⅱ 결핍 마우스의 림프절에는 CD4+ T 세포들이 존재하지 않았다. 그러므로 class Ⅰ또는 Ⅱ MHC 분자들의 부재가 CD8+또는 CD4+ T 세포들의 양성 선택을 각각 차단한다.

14. Effect of host haplotype on T-cell maturation in mice carring transgenes encoding an H-2b class I-restricted T-cell receptor specific for influenza virus

15. Experimental demonstration that negative selection of thymocytes requires both self-antigen, and self MHC 형질전환 마우스 내의 흉선세포들 분석을 통해 암컷 마우스들을 H-Y 에 특이적인 TCR 이식 유전자를 발현하는 흉선 세포들을 가지는 반면 수컷 마우스들은 그렇지 않음이 드러났다. 바꾸어 말하면 H-Y 에 반응하는 흉선 세포들은 수컷 마우스 내에서 자기 반응적이었으며(self-reactive) 제거되었다. 그러나 H-Y항원을 발현하지 않았던 암컷 내에서는 이러한 흉선 세포들은 자기 반응적이지 않았으며 그래서 제거되지 않았다. 이러한 수컷 형질 전환 마우스의 흉선세포들을 배양하였을 때, 흉선 세포들에서 세포자살이 관찰되었는데 이는 음성 선택의 인상적인 한 예를 제시한다.

16. Role of peptides in selection TAP1: transporter associated with antigen processing ►Phenotypes of TAP1 deficiency (KO mice); −low level expression of MHC class I on thymic epithelial cells −No generation of CD8+ T cells Avidityhypothesis: 결합력 가설 Differentialsignaling hypothesis: 감별신호 가설

17. Proposed model for the role of the CD4 and CD8 coreceptors in thymic selection of double positive thymocytes leading to single positive T cells CD4+8+흉선 세포들의 선택은 class I MHC-제한 CD8+T 세포들과 class II MHC-제한 CD4+T 세포들을 생기게 한다. 이중 양성 전구체의 형질전환으로 두 가지의 서로 다른 단일 양성 계통들 중 어느 한쪽이 생성된다고 설명하기 위해 두 가지의 모델이 제시되었다. 지시모델(instructive model) 확률모델(stochastic model)

18. TH cells 활성화 될 때 발현이 유도되는 유전자들 항원과의 상호작용에 의해 발현되는 다수의 유전자 산물들은 항원인식 후 얼마나 시간적으로 신속히 검출될 수 있는지에 따라 세가지 범주들 중의 하나로 구분될 수 있다. 즉각적인 유전자들, 항원인식 후 30분 이내에 발현되는 c-Fos, c-Myc, c-Jun, NFAT 및 NF-κB 등을 포함하는 여러 전사 인자들을 암호화함 초기 유전자들, 항원인식 후 1-2시간 내에 발현되는 IL-2. IL-2R, IL-3, IL-6, IFN-γ 및 여러 가지 기타 단백질들을 암호화함 후기 유전자들, 항원인식 후 2일 이후에 발현되며 여러 가지 부착성 분자들을 암호화함

19. Overview of TCR-mediated signaling MHC-peptide와 TCR 상호작용 CD4/8과연결된 p56lck이 CD3의 ζ chain의 ITAM을 인산화 ITAM 인산화부위에 ZAP-70 결합 내부신호전달자들을 활성화하는 adaptor molecules을 인산화 IS (Immunological synapse): 매우 역동적이고 유기적 구조로 TCR 신호전달의 특징이며, 도넛-모양의 환 형성. TCR 신호개시단계에 요구되진 않지만, 지속적인 T 세포의 활성화에 효율적. ZAP-70: zeta-associated protein of 70 kDa SLP-76: SH2-containing leukocyte-specific protein of 76 kDa LAT: linker of activated T cells GADS: Grb2-like adaptor downstream of Shc ItK: inducible T-cell kinase GEF: guanine nucleotide exchange factor GAP: GTPase activating factor

20. Signal-transduction pathways associated with T-cell activation 포스포리파아제 Cγ(PLCγ): PLCγ는 인산화에 의해서 활성화되고 막 관련 매개 단백질과의 결합에 의해서 기질과 만날 수 있다(a). PLCγ는 막의 인지질 성분을 가수분해하여 이노시톨 삼인산(IP3)과 디아실글리세롤(DAG)을 생성한다. IP3은 소포체로부터 급작스런 칼슘이온의 방출을 유발하며 세포막의 칼슘채널들이 열리게 한다(C). DAG는 여러 다양한 기질들을 인산화하는 다기능적인 단백질 키나제 C를 활성화 한다 (b). Ca2+:칼슘 이온은 시각, 근육수축 및 그 외 다수를 포함하는 대단히 넓은 범위의 과정들에 관련되어 있다. 이는 전사인자인 NFAT를 세포질에서 핵으로 이동하게 하는 경로를 포함하는 다수의 T 세포 반응들에 있어서 필수적인 요소이다(C). 핵 내에서 NFAT는 T세포 성장 촉진하는 싸이토카인 IL-2, IL-4등의 유전자들의 전사를 지원한다. 다음 슬라이드에 계속…

21. Activation of the small G protein, Ras Ras/Map 키나제 경로: Ras는 많은 종류의 세포들에서 발견되고 효모에서 사람에 이르기까지 다양한 진핵 생물들에서 진화상 보존되어 있는 신호전달 경로의 중추적 구성요소이다. Ras는 작은 G 단백질로서 GTP에 의해서 활성화되어 미토겐 활성 단백질 키나제(MAP kinase) 경로로 알려져 있는 단백질 키나제들의 연쇄적 반응을 개시하게 한다. 이 연쇄반응의 최종산물인 맵 키나제(Erk라고도 불림)의 인산화는 Fos의 발현에 요구되는 전사인자인 Elk를 활성화 시킨다. 맵 키나제에 의한 Fos 의 인산화는 Fos가 Jun과 함께 결합하여 T 세포 활성화에 필수적인 전사인자인 AP-1을 형성하게 한다.

22. TH-cell activation requires a co-stimulatory signal provided by antigen-presenting cells (APCs) T 세포 활성화에는 위에서 설명한 다수의 막 분자들 간의 역동적인 상호작용이 요구되지만, 이 상호작용 그 자체만으로는 미경험 T세포들을 완전하게 활성화 시키는데 충분하지 않다. 미경험 T 세포들은 활성화 빛 효과 세포들로의 증식을 위해 한가지 이상의 신호를 필요로 한다. 신호 1 , 개시신호는 항원 펩티드와 TCR-CD3 복합체와의 상호작용에 의해 생성된다. 신호 2, 뒤이은 항원-비특이성 공동자극신호, 즉 신호 2는 T 세포상의 CD28과 APC상의 B7패밀리의 구성원들 사이의 상호작용에 의해 제공된다. B7에는 두 가지 서로 연관성이 있는 형태인 B7-1 및 B7-2가 있다. 이 분자들은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며 세포외부 영역은 유사한 구조이지만 세포내부 영역은 현저히 다르다. CTLA-4: CD28과 구조는 유사하나 서로 길항적으로 작용 B7과 상호작용하여 T 세포의 활성화를 낮춘다. 휴지기 T cells에서는 발현되지 않는다.

23. CTLA-4Ig, a chimeric suppressor of co-stimulation 치료에 이용될 수 있는 CTLA-4의 잠재력을 타진하기 위해 성실하게 설계된 키메라 분자가 고안되었다. CTLA-4 Ig라는 키메라 분자를 생산하기 위해 인간 IgG의 Fc 부분을 CTLA-4의 B7-결합 영역에 융합시켰다. 인간 Fc 부위는 이 분자에게 체내에서의 긴 반감기를 부여하고 B7 결합부위의 존재는 이것이 B7에 결합하게 한다. CTLA-4의 B7 binding domain

24. Experimental demonstration of clonal anergy versus clonal expansion 다음 슬라이드에 설명…

25. 항원 펩티드-MHC 복합체를 TH 세포가 인식하는 결과 어떤 경우에는 펩티드-MHC 복합체에 반응하여 세포가 증식할 수 있는 능력이 없음으로 특징지어지는 클론 아너지라고 불리는 무반응성 상태가 초래된다. 휴지기의 TH 세포들을 B7을 발현하지 않는 글루타르알데히드에 고정된 APCs와 함께 배양을 한다면 고정된 APCs는 펩티드들을 class ⅡMHC 분자들과 함께 제시할 수 있으므로 그래서 신호 1은 제공할 수 있지만, 필요한 공동자극신호 2는 보낼 수가 없다. 공동 자극신호가 없는 경우, 특히 IL-2와 같은 사이토카인이 최소한으로 생산된다. 또한 아너지는 CD28과 B7의 결합을 방해하는 anti-cd28의 Fab부분이 존재하는 조건에서 TH세포들을 정상 APCs와 함께 배양 할 경우에도 유도될 수 있다. T 세포들의 TCR에 인식되는 펩티드-MHC 복합체들을 지닌 채로 고정된 APCs및 B7을 발현하는 정상 APCs 양쪽 모두를 T세포들과 함께 배양한다. 고정된 APCs는 T 세포들의 TCRs와 관계하고, 정상 APCs 표면의 B7분자들은 T세포들 상의 CD28과 결합한다. 그래서 이들 T 세포들은 두 가지 신호들을 모두 받아서 활성화를 진행한다. 고정된 APCs와 T세포들의 혼합물에 항-CD28 을 항체를 첨가하면 CD28와의 결합을 통해 T 세포들에게 효과적인 공동자극신호를 또한 제공할 수 있다.

26. Superantigen-mediated cross-linking of T cell receptor and class II MHC molecules 슈퍼항원들은 T 세포 수용체의 Vβ 영역과 class Ⅱ MHC분자의 α chain에 동시에 결합하는 바이러스성 또는 세균성 단백질들이다. 외인성 및 내인성 슈퍼항원들이 모두 규명되어 있다. 어느 유형의 슈퍼항원이든 이들에 의한 T 세포 수용체와 class Ⅱ MHC 분자간의 교차결합은 T 세포의 활성화와 증식을 유도하는 활성화 신호를 생성한다. Response of T cells to a given conventional antigen:  0.01% Response of T cells to a super antigen:  5% of the T-cell population

27. 외인성 슈퍼항원들은 세균류에 의해 분비되는 가용성 단백질들이다. 이들 중에는 포도상 구균 장독소, 독성 쇼크 증후군 독소, 박탈성 피부염 독소 등과 같은 그람 양성균에 의해서 분비되는 다양한 외독소 들이 있다. 이러한 외인성 슈퍼항원들 각각은 T 세포 수용체들의 특정 V β부위에 결합하며 TCR을 class ⅡMHC 분자에 교차결합시킨다.

28. Activation of a TH cell by both signal 1 and co-stimulatory signal 2 up-regulates expression of IL-2 and the high affinity IL-2R, leading to the entry of the T cell into the cell cycle and several rounds of proliferation 활성화는 TCR 복합체의 관여에 의한 신호와 CD28-B7 상호작용에 의해 유도되는 공동자극신호에 의해 이루어진다. 이러한 신호들은 T세포가 세포주기의 G1기로 진입하는 것을 촉발하며, 동시에 IL-2및 이에 강한 결합을 할 수 있는 고친화성 IL-2 수용체의 α 사슬의 유전자 전사를 유도한다. 또한 공동자극신호는 IL-2 mRNA의 반감기를 증가시킨다. IL-2 mRNA의 안정화와 함께 IL-2 전사의 증가는 활성화된 T 세포들에서의 IL-2 생성을 100배 정도 증가시킨다. IL-2의 분비 및 뒤이은 IL-2의 고친화성 IL-2 수용체와의 결합은 활성화된 미경험 T 세포가 증식하고 분화하도록 유도한다. 이러한 방식으로 활성화된 T 세포들은 매일 2-3번씩 4-5일 동안 분열하여, 자손 세포들로 이루어진 거대한 클론을 형성하고 기억 혹은 효과 T 세포 집단들로 분화하게 된다.

29. Differences in the properties of professional antigen-presenting cells affect their ability to present antigen and induce T-cell activation 전문 항원제시세포들(수지상세포들, 대식세포들, B 세포들)만이 증식 및 분화로 이어지는 T 세포들의 완전한 활성화에 필요한 항원을 classⅡ MHC 분자들과 함께 제시할 수 있으며 공동 자극신호를 전달 할 수 있다. 항원 제시세포들 표면의 중요한 공동자극 분자들은 당단백질인 B7-1, B7-2이다. 전문 항원제시세포들은 항원을 드러내는 방법 및 공동자극 신호를 전달하는 능력도 각각 다르다.

30. Two pathways to apoptosis in T cells 세포는 정상적 환경에서는 세포내의 케스파제(caspases)를 비활성 상태로 유지하여 세포자살에 의한 죽음으로부터 자신을 보호한다. 그러나 적절한 사망신호를 받게 되면, 특정 케스파제가 단백질분해효소 작용을 통해 잘려지게 됨으로 활성화되고, 이어서 다른 케스파제들을 차례로 활성화시켜 효과 케스파제들(effector caspases)을 활성화시키게 된다. 이러한 효소촉매적인 연쇄반응은 세포사멸로 귀결된다. 비록 어떻게 케스파제의 활성화에 의해 세포자살이 직접적으로 초래되는지 잘 알려지지 않았지만, 세포가 생존하기 위해 필요로 하는 특정 단백질들의 분해를 통해 가능한 것으로 짐작된다. T 세포들은 두 가지의 서로 다른 경로를 통해 케스파제를 활성화 시킨다 (a) (b).