第四节分子生物学方法及其在中医研究中的应用

第四节分子生物学方法 及其在中医研究中的应用

本节的教学目的和要求： 1．掌握分子生物学实验研究方法的特点和优势。 2．掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的分子生物学实验技术和综合多种技术。 3．了解分子生物学的主要方法及其在中医研究中的应用。

什么是分子生物学？ 分子生物学在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子（核酸、蛋白质）的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程，比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。

分子生物学是20世纪中叶才诞生并迅速发展起来的学科，被誉为当代最伟大的科学成就之一。如今，分子生物学技术已成为医学领域中使用最为广泛的技术，在揭示新的生命现象、认识和战胜种种疾病等方面起着越来越重要的作用，是带动医药研究的前沿学科。当前，各种分子生物学仪器、试剂盒等纷纷涌现和发展，并迅速地商品化，极大地推动了分子生物学技术的发展与普及应用。分子生物学是20世纪中叶才诞生并迅速发展起来的学科，被誉为当代最伟大的科学成就之一。如今，分子生物学技术已成为医学领域中使用最为广泛的技术，在揭示新的生命现象、认识和战胜种种疾病等方面起着越来越重要的作用，是带动医药研究的前沿学科。当前，各种分子生物学仪器、试剂盒等纷纷涌现和发展，并迅速地商品化，极大地推动了分子生物学技术的发展与普及应用。近几十年来，实验中医学取得了突飞猛进的发展，中医药，包括针灸、推拿、气功在防治疾病方面的疗效已被大量的实验所证实、重复，在此基础上，中医的实验研究已深入到细胞、组织基因表达和调控的层次上来，开始关心中医治法的作用机制，揭示中医药理论的分子内涵；与此同时，以分子生物学技术为核心的基因工程、生物工程在中药及其有效成分产业化方面显示出辉煌的前景。

分子生物学的主要方法有哪些？ ● 教材介绍的分子生物学主要方法有：载体、分子克隆常用酶（限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、连接酶、脱氧核糖核酸酶I、反转录酶）、重组载体、DNA的凝胶电泳、真核细胞RNA的制备、Northern blot、基因表达谱芯片和DNA阵列技术、标记DNA或RNA探针、cDNA文库构建、真核细胞DNA的提取、DNA文库构建、Southern blot、DNA的测序、PCR和RT-PCR、DNA的诱变、克隆化基因在大肠杆菌和哺乳动物培养细胞中表达、克隆化基因所表达蛋白质的检测和分析、Western blot、蛋白双向电泳。

● 与教材其它几类实验技术相比，分子生物学技术的显著特点是揭示生命及其调控机制（包括所涉及的中医药理论和方法的作用机制）。关心和解释“为什么？”

一、分子生物学的主要技术和方法 推荐参考书：（1）黄培堂等译《分子克隆实验指南》，科学技术出版社，2002年8月，第3版。（2）方肇勤主编《分子生物学技术在中医药研究中的应用》，上海科学技术出版社，2008年9月，第2版由于分子生物学技术与方法发展十分迅速，日新月异，因此，我们建议在研究中应及时追踪最新的研究报道，及各有关公司的最新产品介绍。

（一）载体 什么叫载体？常用的载体有哪些？什么叫重组载体？载体：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。重组载体：把目的基因片段插入载体的实验称之为重组载体。其主要目的在于扩大某一目的DNA片段，用以标记探针、测序、建立基因组或cDNA文库等。常用载体如下：

1．质粒 何谓质粒？在分子生物学中具有什么作用？质粒是一些双链、闭环的DNA分子，其大小范围为1kb至200kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位，是最常用的载体。

通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性：通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性： ① 含有多克隆位点区域，即有多个单切点内切酶云集的区域，可方便地插入目的DNA片段。 ② 具有自主复制能力，进入宿主细胞后，能独立于宿主细胞染色体进行复制。 ③ 有药物筛选标志基因。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。 ④ 在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500～700个。因此质粒已成为分子生物学中应用最为广泛的载体。

2．λ噬菌体 λ噬菌体的基因组是一组长度约为50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA为一双链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链（黏端）。当λ噬菌体进入宿主细胞后，其黏端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。实验用λ噬菌体，在其DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段，如有的λ噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。

3．酵母人工染色体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）载体技术是Olson建立的。它含有质粒pBR322中的Ampr抗性基因和ori复制起始序列，使YAC载体可以在大肠杆菌中复制，以便制备大量的YAC DNA。YAC载体能克隆500～1000kb的DNA片段。重组的YAC载体转化酵母细胞，外源基因在酵母细胞内复制，使外源基因稳定扩增。此外还有SV40病毒基因组、考斯质粒、噬菌粒、细菌人工染色体等。

（二）分子克隆常用酶 分子克隆常用哪些酶？分子克隆常用的酶有：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、连接酶、脱氧核糖核酸酶I、反转录酶。

何谓限制性核酸内切酶？常用的有哪些？ 1．限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能特异性地结合于一段该酶能识别的双链DNA序列上，通常为4～8个碱基对，水解DNA磷酸二酯键，从而切割双链DNA的核酸水解酶。常用的限制性内切酶有：

（1）黏性末端：即指DNA片段双链的两端含有几个延伸等长的碱基互补配对的核苷酸单链末端，称为黏性末端。限制酶在二重对称轴的5’侧切割底物DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的黏端的DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如下：（1）黏性末端：即指DNA片段双链的两端含有几个延伸等长的碱基互补配对的核苷酸单链末端，称为黏性末端。限制酶在二重对称轴的5’侧切割底物DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的黏端的DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如下： ↓ 5’N N N N N C T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T C N N N N N5’ ↑ 切割后产生两片段： 5’N N N N N C T G CA pG N N N N N3’ 3’N N N N N Gp A C G T C N N N N N5’ 这类限制酶主要有：BamH I、BglⅡ、EcoR I、Hind Ⅲ、Kpn I、Pst I等等。

（2）钝性末端：有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生带平端的DNA片段。例如：HaeⅢ识别双链DNA的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5’N N N N N N G G C C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C C G G N N N N N N5’ ↑ 切割后产生平端的片段： 5’N N N N N N G G pCC N N N N N N3’ 3’N N N N N N CCp G G N N N N N N5’ 这类限制酶主要有：HaeⅢ、Mst I、Sca I、Sma I等等。

什么叫DNA聚合酶？主要有哪些？有什么作用？ 2．DNA聚合酶 DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸合成DNA，催化脱氧核苷酸3’-OH与脱氧核苷酸5’-P之间形成磷酸二酯键的反应。主要用于催化DNA 体外合成反应。真核细胞有5种DNA聚合酶；原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。最常用DNA聚合酶有PCR用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）等。

连接酶的用途是什么？ 3．连接酶连接酶使各具有游离的5’-P和3’-OH的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，将两段DNA连接起来。最常用的是T4噬菌体连接酶。何谓脱氧核糖核酸酶？ 4．脱氧核糖核酸酶 I DNA酶I为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物为5’端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。

反转录酶的用途是什么？ 5．反转录酶反转录酶能以RNA为模板催化合成互补DNA链。

（三）重组载体 重组载体的方法：采用某限制酶切割开载体，用DNA连接酶将载体DNA片段与拟插入的目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时，插入片段的平端与载体的平端对接，插入片段的黏端与载体的黏端对接，两个黏端的序列互补。实现载体重组。载体重组后，转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所含抗生素抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落。可以采用原位杂交；或扩增阳性单菌落，小量制备DNA，限制酶酶切、电泳，鉴定重组成功与否。重组成功者可用于各有关实验。

左上：质粒载体。左下：λ噬菌体载体。右质粒重组示意图。左上：质粒载体。左下：λ噬菌体载体。右质粒重组示意图。

（四）DNA的凝胶电泳 为什么要DNA凝胶电泳？常用的DNA凝胶电泳有哪些？为了鉴别或分离分子量不同大小的DNA或RNA片段，最常用的方法就是凝胶电泳。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。

1．琼脂糖凝胶电泳为水平电泳，可分离200bp～50kb的DNA，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至50ng的DNA，甚至10ngDNA也能辨别得出来，分子生物学中常用此分离和鉴定RNA和DNA。1．琼脂糖凝胶电泳为水平电泳，可分离200bp～50kb的DNA，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至50ng的DNA，甚至10ngDNA也能辨别得出来，分子生物学中常用此分离和鉴定RNA和DNA。

2．聚丙烯酰胺凝胶电泳多为垂直电泳，多用于分离5～500bp的DNA，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA，所以常用来测序。DDPCR、Footprint等DNA电泳，以及蛋白电泳也常用此胶。2．聚丙烯酰胺凝胶电泳多为垂直电泳，多用于分离5～500bp的DNA，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA，所以常用来测序。DDPCR、Footprint等DNA电泳，以及蛋白电泳也常用此胶。

（五）真核细胞RNA的制备 为什么要制备RNA？在RNA制备过程中需要注意什么？真核细胞RNA的制备方法有多种，还有许多种商品试剂盒出售，性能稳定，重复性好。实验室比较常用的是制备总RNA一步法。该方法操作简便，一次可以分离大量的RNA，原理是采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍等，抑制RNA的降解，并使RNA与蛋白质分离进入溶液，离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，之后被异丙醇沉淀。提取的RNA可用于Northern blot和过Oligo dT柱。后者用于分离mRNA。

以上依次为匀浆设备、匀浆管和杵、匀浆过程、酚氯仿抽提结果以上依次为匀浆设备、匀浆管和杵、匀浆过程、酚氯仿抽提结果

（六）Northern blot 什么叫Northern blot？什么叫Southern blot？各自具有什么作用？ Northern blot即RNA印迹法。该方法首先将RNA电泳分离，再把RNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，固定，然后用已知DNA或RNA作探针，杂交，分析所检测的RNA。这是常用的分析RNA的方法。近似的还有RNA的斑点杂交和狭缝杂交。

RNA转移示意图，以及Northern blot放射自显影结果

Northern blot的用途： （1）鉴定某一基因是否有所转录，有则可见杂交带。（2）估计目的RNA的分子量大小。（3）比较不同组织或细胞的某一基因转录量的差异；并可以对杂交带进行光密度扫描，对某一基因转录的情况作定量分析。

在中医药实验中通常用此方法来检测某一病理组织基因表达水平和某一中医药方法对某一基因转录的调控作用。方法是采用琼脂糖凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。运用虹吸法或电转移印迹法将RNA转移至硝酸纤维素膜上，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记或其他方法标记的探针杂交，杂交后洗去未被结合的探针，进行放射自显影或直接观察杂交结果（适用于一些非放射性标记探针的方法），在胶片上出现被检测的mRNA显影条带；也可以用冷CCD照相机直接对杂交膜进行拍照，分析被检测mRNA杂交条带。在中医药实验中通常用此方法来检测某一病理组织基因表达水平和某一中医药方法对某一基因转录的调控作用。方法是采用琼脂糖凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。运用虹吸法或电转移印迹法将RNA转移至硝酸纤维素膜上，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记或其他方法标记的探针杂交，杂交后洗去未被结合的探针，进行放射自显影或直接观察杂交结果（适用于一些非放射性标记探针的方法），在胶片上出现被检测的mRNA显影条带；也可以用冷CCD照相机直接对杂交膜进行拍照，分析被检测mRNA杂交条带。

（七）基因表达谱芯片和DNA阵列技术 这类技术主要用于检测目标组织多RNA转录的差异。主要有两种检测方式： 1．基因芯片（Micro array）什么叫基因芯片？派什么用处？基因芯片与Northern blot的目的有何异同？基因芯片又称基因表达谱芯片，特点是把成千上万个基因高密度地点涂或压印在包被的载体上，一次检测可多达数万个基因。该方法进而发展出外显子芯片（Exon Array），可以进一步观察某基因各外显子剪接的差异。

2．cDNA阵列（cDNA Array） 该技术把几十至上万个基因点涂在96孔板大小的硝酸纤维素膜上，一次检测可多达上万个基因。实验时，将用荧光或同位素标记的待测核酸样品与以上Array进行杂交，杂交后用高分辨率的激光扫描仪检测荧光标记，再用数字成像软件分析每个点发出的信号，即可获得基因表达谱；或放射自显影（适用于同位素标记的探针）。用此方法可将实验样品与对照组的基因表达谱进行差异分析。

（八）标记DNA或RNA探针 什么叫探针？探针是用来做什么的？探针：探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。标记探针：把已知DNA或RNA作为模板，用一些特定的方法把一些易于检测的化学物质标记到合成的另一条核酸链上，以便检测之用。用途：通过杂交，使探针与被检测的样本DNA或RNA结合，使痕量的DNA或RNA得以显示出来。常用的标记放射性同位素有32P和35S，能用于检测极微量的靶DNA或RNA；非放射性标记物有生物素、地高辛、荧光素等。

（九）cDNA文库构建 cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 DNA文库：某一特定来源DNA通过细胞－DNA克隆技术构建呈含有所用DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，构成DNA文库。

cDNA文库的构建方法： 把目的细胞所有的带聚腺苷酸（poly A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，进而将此DNA插入原核或真核载体，扩增，回收扩增了的DNA，这一工作称之为构建cDNA文库。构建文库对RNA质量要求高，既要保证不污染，又要保证mRNA的完整性。构建的文库主要用于识别或分离某一或若干特定的cDNA全部序列。

左图：cDNA库构建原理 右图：cDNA库的滴定

cDNA文库与DNA文库的区别是什么？ cDNA文库与DNA文库的区别：基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

（十）真核细胞DNA的提取 提取真核细胞DNA有不同的方法，通常在含有EDTA和SDS一类去污剂的溶液中，用蛋白酶K消化细胞，再用酚抽提得到高分子量（100～150kb）的DNA。适用于Southern blot分析和构建DNA文库。

（十一）DNA文库构建 对所提取的DNA用一至多种限制酶消化（基因组DNA分子量太大，难以建库），使消化后的DNA片段在一定的长度内，适合所用的载体。载体多用λ噬菌体。重组载体及随后的工作与cDNA文库建立方法相似。

（十二）Southern blot Southern blot是DNA印迹杂交，是常用的分析DNA方法。即用一种或多种限制酶消化DNA，琼脂糖凝胶电泳把分子量大小不等的DNA分开，运用虹吸或电印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上，固定，使DNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记或非放射性标记的探针杂交，杂交后洗去未被结合的探针，进行放射自显影或X光片曝光，在胶片上出现被检测的DNA显影条带；也可以用冷CCD照相机直接对杂交膜进行拍照，分析被检测DNA杂交条带。 Southern blot主要用于基因组DNA特定序列定位和定量。

（十三）DNA的测序 DNA测序最常用的是双脱氧链终止法。原理：采用了2’、3’ddNTP，在3’位置上缺少一个羟基，当这些ddNTP掺入到正在延长的DNA链上，由于缺乏3’羟基，后继的dNTP不能与之形成磷酸二酯键，从而使DNA链终止延伸。于是，在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入少量的一种ddNTP，将得到一系列不同长度的核苷酸链，其长度取决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在4组独立的反应体系中，加入4种不同的ddNTP（和一种经标记的dNTP），结果将产生4组长度不均的寡核苷酸，分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。然后采用能分辨长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，把4组反应液加样于凝胶顶部若干相邻的泳道上，电泳分离之后，从凝胶的放射自显影片上可直接读出DNA上的核苷酸序列。

目前使用最为广泛的是DNA自动测序仪，及其配套的试剂盒。自动测序仪是20世纪80年代早期发展起来的，用荧光染料标记DNA分子来代替同位素标记。染料分子用激光激活，荧光信号被放大，再被CCD相机捕获，计算机根据不同染料的颜色（发射波长）来判断不同的核苷酸，根据荧光峰的形状和连续峰之间的距离识别每个碱基。自动测序仪极大地提高了测序效率，一个熟练的研究员运用毛细管测序仪一星期能处理5000个样品，每个可平均读600个碱基。目前使用最为广泛的是DNA自动测序仪，及其配套的试剂盒。自动测序仪是20世纪80年代早期发展起来的，用荧光染料标记DNA分子来代替同位素标记。染料分子用激光激活，荧光信号被放大，再被CCD相机捕获，计算机根据不同染料的颜色（发射波长）来判断不同的核苷酸，根据荧光峰的形状和连续峰之间的距离识别每个碱基。自动测序仪极大地提高了测序效率，一个熟练的研究员运用毛细管测序仪一星期能处理5000个样品，每个可平均读600个碱基。

（十四）PCR、DDPCR和RT-PCR 什么是PCR？PCR的用途是什么？ 1．PCR PCR是Polymerase chain reaction的缩写，聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将微量DNA（含由RNA反转录成的微量DNA）扩增达106倍，得到μg级的DNA！该技术发明于20世纪80年代中期，到了80年代末，由于引用了耐热DNA聚合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益重要的作用。

PCR的原理是选用两段引物，分别与拟扩增的模板DNA两条链上各一段序列互补，且分别位于模板DNA中拟扩增DNA片段两条链的3’端。加热使模板DNA变性，解链；随后的降温，使两段引物分别与靶序列发生退火，然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4种dNTP的反应体中，位于两段引物间的DNA在反复变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过30～40个循环，目的DNA可由原来的1pg扩增到1μg。PCR的原理是选用两段引物，分别与拟扩增的模板DNA两条链上各一段序列互补，且分别位于模板DNA中拟扩增DNA片段两条链的3’端。加热使模板DNA变性，解链；随后的降温，使两段引物分别与靶序列发生退火，然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4种dNTP的反应体中，位于两段引物间的DNA在反复变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过30～40个循环，目的DNA可由原来的1pg扩增到1μg。

实时荧光定量PCR与普通PCR原理的区别？ 2．实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术通过不同浓度模板标准品扩增，所得到的标准曲线，可以用以判断待测样品起始拷贝数。该技术可以选择采用多种化学燃料，常用的是SYBR Green I，为双链DNA结合染料，与双链DNA的小沟结合而所产生荧光大大增强。在通常PCR反应中加入0.2～1单位的UNG酶，以及1:20000稀释的SYBR Green I。

左上：实时定量 PCR仪右上：该仪的部分工作原理下：实验结果的输出

第四节分子生物学方法及其在中医研究中的应用