slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. PowerPoint Presentation
Download Presentation
ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 41

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. - PowerPoint PPT Presentation


  • 91 Views
  • Uploaded on

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY (HIC). TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.' - kami


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

Dr. Kremmer Tibor

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM

Budapest

slide3

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS

  • 1971 Affinitási kromatográfiás tölteteknél spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos kölcsönhatásokat figyelnek meg
  • 1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography
  • Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra alkilaminokat alkalmaz
  • 1973 Hjerten Hydrophobic Interaction Chromatography
  • PorathHydrophobic Salting-out Chromatography
  • Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék retenciója nő
  • Hoftsee Hydrophobic Adsorption Chromatography
  • A ligandum szénláncának növelése és sűrűségének csökkentése növeli az eljárás felbontóképességét
  • 1976 MorrisHIC (Trends Biochem Sci.)
  • 1980 - HPLC töltetek
  • 5-10 m szemcseméret (analitikai)
  • 20-40 m szemcseméret (preparatív), pórusméret növelése (300Å)
  • 1986 Nem porózus töltetek (1-3 um)
  • Perfúziós töltetek (200 és 300-500 nm pórus)
slide6

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC)

KÜLÖNBÖZŐ LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA

(Gooding et al. 1984)

OH-Propil → Propil → Benzil → i-Propil → Fenil → Pentil

 a retenció növekedése 

slide7

KÜLÖNBÖZŐ ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSRA

PO43- ~ SO42- ~ CH3COO- ~ Cl- ~ Br- ~ NO3- ~ CIO4- ~ SCN-

növekvő besózó - csökkenő kisózó hatás

    • növekvő kaotrop - csökkenő kozmotrop hatás
  • NH4+ ~ Rb+ ~ K+ ~ Na+ ~ Cs+ ~ Li+ ~ Mg2+ ~ Ca2+ ~ Ba2+
  • Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala
slide8

HUMÁN SZÉRUM

SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT)

ELVÁLASZTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIÁVAL

Fractogel EMD Propyl oszlop (10x1 cm, 20-40 m)

Eluens A – 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 1,1 M NH4-szulfát

Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2

Lineáris gradiens elúció

Áramlási sebesség : 1 mL/perc

Detektálás : 278 nm

(Oláh, Kremmer, Boldizsár, J. Chromatogr. 2000)

(NH4)2SO4

1,5 M

slide9

REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

M

(NH4)2SO4

slide10

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA

FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK

slide11

Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins

Column A: Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm ID, 2.5μm particles

Column B: Progel-TSK Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles

Column C: ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles

Mobile Phase: A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 and 2.3 → 0M ammonium sulfate (12 min)

B - C = 0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 → 0M ammonium sulfate (60 min)

Flow rate: 1mL/min; Temp.: 250 C; Detection: UV 280 nm

  • Samples: 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae, 3. Lysozyme, 4. -Chymotrypsin, 5.   -Chymotrypsinogen
slide12

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI

A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA

II. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA

  • 1 - Kis sókoncentrációk
  • - ionos kölcsönhatások
  • - stabilizálás
  • 2 - Nagy sókoncentrációk
  • - speciális kölcsönhatások, kozmotróp sópárok,
  • pl. (NH4)2SO4
  • - stabilizálás, majd kicsapódás,
  •  hidrofób kölcsönhatások
slide14

A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC)

ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA

Mindkét technikában közös és jellemző:

- Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum.

- A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás.

- A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg.

- Mindkét technika alkalmas a fehérjék elválasztására.

slide15

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI

  • - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja.
  • A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye.
  • A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg.
  • - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye.
  • A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős,
  • a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező
slide16

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI

A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA

I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN

      • A fehérjék fiziológiás körülmények (pH, ionerősség) között harmadlagos ill. negyedleges szerkezettel (folded) rendelkeznek.
      • A fehérjék apoláros karakterű aminosav összetevői (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet belsejébe törekszenek, egy részük azonban a felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb. a felület 40%-át képezi, és fontos funkcionális szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában.
      • Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes oldatokban a víz molekulái un. "icebergs" formában fedik a hidrofób felületeket.
      • Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób anyag vizes oldatban létrejövő kapcsolata során a víz jégszerű struktúrája mintegy feloldódik és dezorganizálódik (entrópia nő – az energia felszabadulás fedezi az asszociáció energiaigényét)
  • Vizes oldatokban ezek az erők stabilizálják a fehérjék natív szerkezetét.
  • A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben általában jól oldódnak (stabilak) és
  • nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.
slide17

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI

A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA

III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA

  • Melander és Horváth (1977)SZOLVOFÓB ELMÉLET
  • - Az oldódás során az oldószer az oldandó anyagot befogadó üreget (cavity)
  • képez.
  • - Az oldhatóság a határfelületi szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami
  • az oldószer felületi feszültségétől függ.
  • - Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az oldat felületi feszültsége
  • arányosan változik:
  • V = Vo + c . R . m R - a víz felületi feszültsége
  • c - a só moláris felületi feszültség inkrementuma
  • - c korrelációba hozható a sók (anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888).
  • - Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat számára legegyszerűbb formájában a retenció kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad.
  • A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a következő egyenlettel fejezhető ki :
  • ln k = ln kviz + S. m
  • az egyenes tengelymetszete (elvileg) a tiszta vízben mérhető kapacitási faktor
  • logaritmusa.
  • - A konkrét mérések az elmélet számos bizonytalanságára hívják fel a figyelmet.
slide18

PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLET

Timasheff (1959) Arakawa és Timasheff (1982)

-  Egy egyensúlyi rendszerben lévő oldathoz adott komponens megváltoztatja a fennálló egyensúlyt.

-  Az új komponens nem egyforma mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévő komponensekkel (preferentíal interaction), ezt fejezi ki a preferential interaction paraméter (PIP).

-  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai potenciál változásának mérésével lehetséges, ez arányos a felületi feszültség változással.

-  Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp sók) a fehérjék környezetében negatív PIP értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék közeléből. Ennek eredménye egy többlet hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet.

-  A só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás eredője:

1. kedvezőtlen felületi feszültség változás

2. kedvező só kötődés

A kisózó szerek esetében az első hatás a domináns (egyértékű kationok sói), a besózó szerek esetében a második kompenzálja az elsőt.

slide19

A ligandum szerkezetének szerepe az albumin kötödésében a hidrofób kölcsönhatású kromatográfiában

slide23
AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

AFFINITY CHROMATOGRAPHY

(AFF)

slide25

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

  • ALAPELV
  • Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített
  • különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek
  • Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibiliskölcsönhatásokat képeznek.
  • Mátrix:
  • - Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose)
          • cellulóz
  • - Organikus polimerek:
          • poliakrilamid
          • hidroxialkil metakrilát (Spheron)
          • etilénglikol metakrilát (Fractogel)
  • - kevert agaróz-poliakrilamid        (Ultrogel)
  • - Silica, "porózus üveg"                (SelectiSphere)
slide26

AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK

(IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES)

IMMUNOAFFINITY (immunosorption)

LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides)

HORMONES (receptors/carriers/antihormones)

PROTEINS (enzymes, immunoglobulins)

SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators)

NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose)

VÍRUS binding ligands

PHENYL BORONATE binding (cis-diols)

IMMOBILIZED METAL ION binding affinity

DYE-LIGAND binding affinity

- Cibacron Blue F3G-A

- Malachit Green (A/T specific)

- Phenol Red (G/C specific)

slide28

LECTINS

FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS

  • With N-linked sugars
  • Lectin-AAA
    • Lectin-DSA
        • Lectin-GNA
        • Lectin-MAA
        • Lectin-SNA
        • Lectin-PHA-L
      • Specificity for structures
      • L-Fuc(l-6)GIcNAcl
          • Galβ(l-4)GlcNAc-
        • Man (l-3)62 Man-
    • SA (2-3)Gal
          • SA (2-6)Gal
  • Poly-Gal-GlcNAc-
      • With O-linked sugars
      • Lectin-ACA
    • Lectin-PNA
    • Lectin-ConA
    • Lectin-RCA-120
  • Lectin-WGA

SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr

Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

slide29

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

Ready-to-use group specific adsorbents

slide30

Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása

L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

slide31

FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

slide32

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS

        • FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A
        • AFFINITY PACKING MATERIALS:
  • (Capacities  10 mg albumin per ml gel)
  • ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia)
    • ~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad)
    • ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M
    • COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5)
    • CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm)
    • ELUTION:
    • Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer
    • pH: 5.8 or 6.8
    • Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer
    • pH:8.0 containing 2 M NaCl
    • FLOW RATE: 1 ml / min
      • SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25
      • Equivalent to 50 μL of original serum
slide35

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF

HUMAN SERUM PROTEINS

COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8

Human serum samples prepared by Sephadex G-25

slide39

PSEUDO-URIDINE DETERMINATION

    • PRINCIPLE
  • NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC.
        • SAMPLE PREPARATION
      • MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY
        • COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL.
      • HPLC ANALYSIS
  • HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL.,
  • COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min.
  • DETECTION: 254 nm.