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maximal methodisch. www.charite.de/maximalmethodisch. +. Durchflusszytometrie (2): DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen Stephan Lobitz Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK). Wofür braucht man das ?.

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maximal methodisch
maximal methodisch

www.charite.de/maximalmethodisch

slide2

+

Durchflusszytometrie (2):DNA-Gehalt- und ZellzyklusmessungenStephan LobitzKlinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK)

wof r braucht man das
Wofür braucht man das ?
  • Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie)
  • Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate- DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest
dna f rbung grundprinzip
DNA-Färbung: Grundprinzip

Der fluoreszierende Farbstoff

Propidiumiodid interkaliert in DNA

In einem gewissen Bereich geschieht

das stöchiometrisch

=> Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz

ein protokoll
(Ein) Protokoll

Man nehme:

  • 70 % Methanol (EISKALT!!!)
  • RNAse-Stocklösung (1 mg/ml)
  • Propidiumjodid-Stocklösung (1 mg/ml)
  • PBS mit 2 % FKS
  • 1 diploider Standard als Kontrolle
ein protokoll1
(Ein) Protokoll
  • Zellen pelletieren
  • Unter starkem Vortexen mit eiskaltem Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren
  • Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben
  • Erneut pelletieren
ein protokoll2
(Ein) Protokoll
  • Pellet in 425 µl PBS resuspendieren
  • 50 µl RNAse (1 mg/ml) zugeben
  • 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren
  • 25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml) zugeben
  • Messen
ein protokoll3
(Ein) Protokoll

Beim Messen beachten:

  • 50.000 events registrieren
  • Flow-Rate auf low stellen
  • Max. 300 Zellen/Sekunde messen
  • Beachten, dass DDM-Parameter aktiviert sind (dazu später mehr...)
partikel werden mit einem laser beschossen

Laser

Partikel werden mit einem Laser beschossen

Detektor

Was kommt hinten raus?

Was steck ich vorne rein?

Partikeleigenschaften

der calibur hat zwei laser

FL1

SSC

FL2

FL4

FL3

.

Blauer

Argon-Laser 488 nm

RoterDioden-Laser~635 nm

FSC

FlowCell

Der Calibur hat zwei Laser
der calibur misst

FL1

SSC

FL2

FL4

FL3

.

Blauer

Argon-Laser 488 nm

RoterDioden-Laser~635 nm

FSC

FlowCell

Der Calibur misst:

Interne Partikel-

komplexität (SSC)

FL-1

FL-2

FL-4

FL-3

Partikelgröße (FSC)

umwandlung des lichtsignals in einen spannungspuls am detektor
Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor

Laser

Spannung

Zeit

Laser

Spannung

Zeit

Spannung

Laser

Zeit

ein spannungspuls kann nach 3 kriterien ausgewertet werden
Ein Spannungspuls kann nach3 Kriterien ausgewertet werden

Pulsfläche (A)

Pulshöhe (H)

Volt

0

40

Zeit (µs)

Pulsweite (W)

= Dauer

weil die software routinem ig nur die pulsh he aufzeichnet
Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet

Pulsfläche (A)

Pulshöhe (H)

Volt

0

40

Zeit (µs)

Pulsweite (W)

ber pulsweite und fl che kann man aber einzelzellen von aggregaten unterscheiden
Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden...

Laser

Laser

Spannung

Spannung

Zeit

Zeit

Spannung

Spannung

Laser

Laser

Zeit

Zeit

Spannung

Spannung

Laser

Laser

Zeit

Zeit

denn einzelzellen und dubletten unterscheiden sich in pulsweite und fl che
... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche

Pulsfläche (A)

Pulshöhe (H)

Volt

0

Zeit (µs)

Pulsweite (W)

Pulsweite (W)

- aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe

zur ck zum problem die cellquest software zeichnet routinem ig nur die h he eines pulses auf

DDM = doublet discrimination

Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf

Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter

es werden alle drei parameter h he weite fl che aufgezeichnet nicht nur die h he
Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!!

(Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)

slide25

Spannung

Zeit

Jetzt wird‘s richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!!

Die THEORIE:

  • G1:
  • 1. Signal deutlich niedriger
  • viel weniger Fläche

2. etwas kleinere Zellen

  • etwas kürzere Dauer
  • G2:
  • 1. Signal deutlich höher
  • viel mehr Fläche

2. etwas größere Zellen

  • etwas längere Dauer

Spannung

Zeit

Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche

slide26

Spannung

Zeit

Weiter gut AUFPASSEN!!!!!

Einzellzellen

  • G2:
  • 1. Signal deutlich höher
  • viel mehr Fläche

2. etwas größere Zellen

  • etwas längere Dauer

Spannung

FL-3-Fläche

Zeit

  • G1:
  • 1. Signal deutlich niedriger
  • viel weniger Fläche

2. etwas kleinere Zellen

  • etwas kürzere Dauer

FL-3-Weite

Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal

der beweis dass man die richtigen zellen ausgew hlt hat
Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt hat...

FL3-Höhe

FL3-Fläche

Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe

slide28

Einzelzell-

diskriminierung

Der erwähnte lineare Zusammenhang

G1/G0

CV als Gütekriterium

G2/M

Dazwischen: S-Phase

Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose

durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper

auswertung der daten i
Auswertung der Daten I
  • Innerhalb von CellQuestVorteil: einfach und billigNachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt

(vgl. Dean PN, J Cell Biol. 1974 Feb;60(2):523-7)

slide30

Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit

G0/G1

G2/M

S

Wieder die Einzelzell-

diskriminierung

f r fortgeschrittene mehrparametrische messungen
Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen
  • Verwendung anderer Farbstoffe

z.B. 7-AAD statt PI (teurer und aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper

  • Darstellung der S-Phase durch BrdU-Pulsbehandlung
f r fortgeschrittene mehrparametrische messungen1
Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen
  • Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3)
  • Trennung von Tumor- und Normal-population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)
weitere infos und software download
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„Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen“

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