SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE

1. SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE E. coli: 4.6 X 106 bp genome size, in terreni ricchi. G= 22’, aerobiosi, per produzione di proteine ricombinanti.

2. SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE S. cerevisiae: 14 x 106 bp genome size, ben nota la biologia molecolare e il metabolismo, genoma totalmente sequenziato nel 1996, impiegato per la produzione di proteine ricombinanti da eucarioti.

3. PROCEDIMENTO DI CLONAZIONE DEL DNA RICOMBINANTE

6. ENZIMI DI RESTRIZIONE ISOLATI DAI BATTERI RICONOSCONO BREVI SEQUENZE DI DNA E TAGLIANO MOLECOLE DI DNA IN SITI SPECIFICI (SITI DI RICONOSCMENTO) RICONOSCONO COME SITI “TARGET” ESANUCLEOTIDI MA ANCHE SEQUENZE DI DNA DI 4,5,8 NUCLEOTIDI

7. EcoRI:TAGLIO SIMMETRICO E SFALSATO

11. ENZIMI DI RESTRIZIONE 3 CLASSI: TIPO I E III: ATTIVITA’ DI RESTRIZIONE E DI METILAZIONE NELLA STESSA MOLECOLA. ASPECIFICITA’ DI TAGLIO: NON USATI IN BIOLOGIA MOLECOLARE. TIPO II: 2 ATTIVITA’ SU MOLECOLE DISTINTE. ELEVATA SPECIFICITA’ DI TAGLIO. NOMENCLATURA GENERE E SPECIE DEL BATTERIO DA CUI E’ STATO ISOLATO. ISOSCHIZOMERI RICONOSCONO LA STESSA SEQUENZA DI TAGLIO. SPECIFICITA’ SITO SPECIFICA E FREQUENZA DI TAGLIO

13. ENZIMI DI RESTRIZIONE LA MAGGIOR PARTE FUNZIONA IN SEMPLICI TAMPONI TRA pH 7 E 8, DI SOLITO A 37°C. (SPECIFICHE DEL FORNITORE) UNITA’ DI ENZIMA “EFFETTO STAR”

14. ENZIMI DI RESTRIZIONE: MODALITA’ DI TAGLIO

16. VETTORI PLASMIDICI MOLECOLE DI DNA CIRCOLARI, A DOPPIO FILAMENTO CAPACI DI AUTOREPLICAZIONE CHE SI MANTENGONO NEI BATTERI COME ENTITA’ EXTRACROMOSOMALI INDIPENDENTI

24. TIPI DI PLASMIDI PLASMIDI F PLASMIDI R PLASMIDI DEGRADATIVI PLASMIDI CRIPTICI PLASMIDI DI GRUPPO DI INCOMPATIBILITA’ PLASMIDI A CAMPO DI OSPITI RISTRETTO E LARGO PLASMIDI INGEGNERIZZATI GENETICAMENTE

29. FOSFATASI ALCALINA ENZIMA CHE RIMUOVE I GRUPPI FOSFATO 5’ DAL DNA PLASMIDICO RESO LINEARE (DEFOSFORILAZIONE)

30. TRASFORMAZIONE PROCESSO CON IL QUALE SI INTRODUCE DNA PURIFICATO IN UNA CELLULA BATTERICA TRATTAMENTO PRELIMINARE DI E. coli CON CLORURO DI CALCIO (CaCL2) CARATTERISTICHE DELLA CELLULA OSPITE: PRIVE DI GENI PER GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (Per evitare la degradazione del clone) NEGATIVE ALLA RICOMBINAZIONE (RecA-) (Per evitare che il DNA inserto venga alterato)

31. SELEZIONE E SCREENING DI MOLECOLE RICOMBINANTI ES. SISTEMA pBR322 RECANTE UN DNA BERSAGLIO INSERITO IN UN SITO BamHI (SISTEMA SENSIBILE ALLA TETRACICLINA) I TAPPA PIASTRATURA DELLE CELLULE CONTENENTI LA MISCELA DI TRASFORMAZIONE SU MEZZO CON AMPICILLINA

35. PROCEDIMENTO DI SELEZIONE DI pUC19 PIASTRATURA DELLE CELLULE OSPITI SU UN MEZZO (LB) CONTENENTE AMPICILLINA, IPTG E X-Gal CRESCITA IN PRESENZA DI IPTG (ISOPROPIL-BETA-D-TIOGALATTOPIRANOSIDE) INDUTTORE DELL’OPERONE lac------- IL REPRESSORE PRODOTTO DA lacI NON SI LEGA ALL’OPERATORE DI lacZ’------ TRASCRIZIONE DI lacZ’------BETA-GALATTOSIDASI ATTIVA PRESENZA DI X-Gal SUBSTRATO (5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLIL-BETA.D-GALATTOPIRANOSIDE) L’X-Gal VIENE IDROLIZZATO DALLA BETA-GALATTOSIDASI IN UN PRODOTTO DI COLORE BLU.

36. SELEZIONE CELLULE + pUC19 INTATTO: CRESCONO IN AMP -------- COLONIE BLU 2. CELLULE + pUC19-DNA CLONATO: CRESCONO IN AMP -------- COLONIE BIANCHE 3. CELLULE NON TRASFORMATE: NON CRESCONO IN PRESENZA DI AMP.

41. Vettori per la clonazione di frammenti di DNA di grandi dimensioni VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO l Formazione di genoteche (DNA > 10kb) COSMIDI DNA clonato di 40 kb SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A INSERTO MOLTO GRANDE DNA clonato > 100 kb

42. VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO l CICLO LITICO E LISOGENO LUNGHEZZA DNA DEL BATTERIOFAGO l: 50 kb. 20 kb INDISPENSABILI PER EVENTI DI INTEGRAZIONE-ESCISSIONE (I/E) SOSTITUZIONE DI QUESTE 20 kb CON ALTRETTANTE DI DNA CLONATO BATTERIOFAGO LAMDA “RICOMBINANTE” (Cicli litici obbligatori)

59. I COSMIDI 40 kb DI DNA CLONATO MANTENUTI SOTTO FORMA DI PLASMIDI IN E. coli PROPRIETA’ DEI PLASMIDI E DI VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO LAMBDA

60. I COSMIDI DUPLICE VANTAGGIO GRUPPI DI GENI E GENI GRANDI VENGONO CLONATI PIU’ FACILMENTE SCREENING DI UN NUMERO MINORE DI CLONI AI FINI DELLA CREAZIONE DI UNA GENOTECA

64. SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A INSERTO MOLTO GRANDE (>100kb) FACILITANO L’ANALISI DEI GENOMI EUCARIOTICI COMPLESSI INDISPENSABILI PER: MAPPATURA GENOMA UMANO SCOPERTA DI GENI UMANI ESEMPIO: CROMOSOMI ARTIFICIALI BATTERICI (BAC): COSTRUTTI VETTORE-INSERTO BASATI SUL PLASMIDE F

69. TRASFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI TRASFERIMENTO DI DNA IN E. coli (TRASFORMAZIONE) CaCl2 ICE-COLD HEAT SHOCK 90S, 42 °C EFFICIENZA: 107-108/mg DNA PERMEABILIZZAZIONE DELLA MEMBRANA MEDIATA DA CAMPO ELETTRICO E. coli: - 25 microfarad - 2,5 kilovolts - 200 ohm - 4,6 millisecondi Efficienza: 109/mg DNA CONIUGAZIONE

73. CONIUGAZIONE BATTERICA La maggior parte dei plasmidi utilizzati nella ricerca è priva di funzioni coniugative, sicchè il DNA di questi plasmidi non può essere trasmesso alle cellule riceventi per coniugazione. Introducendo un plasmide con funzioni coniugative in una cellula batterica già in possesso di un vettore plasmidico mobilizzabile, si può trasferire il suddetto vettore a una cellula ricevente.

74. MESCOLAMENTO DI 3 CEPPI A: plasmide mobilizzabile coniugativo B: vettore di clonazione mobilizzabile non coniugativo (di interesse) C: cellula ricevente bersaglio

75. ESEMPIO DI SELEZIONE Ceppo A: non può crescere su mezzo minimo, AMP sensibile Ceppo B: non può crescere su mezzo minimo, AMP resistente Ceppo C: cresce su mezzo minimo, AMP sensibile

76. Avvenute le coniugazioni…. Crescita delle cellule per breve tempo su mezzo ricco senza AMP Trasferimento delle cellule su mezzo minimo con AMP Quali cellule potranno crescere in tali condizioni

77. …. CELLULE BERSAGLIO CHE HANNO ACQUISTATO IL VETTORE DI CLONAZIONE PLASMIDICO!