Запрограммированная смерть одноклеточных эукариот.

1. Запрограммированная смерть одноклеточных эукариот. Федор Северин НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ severin@mail.genebee.msu.ru http://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru

2. почему этой проблемой стоит заниматься?

3. почему этой проблемой стоит заниматься? - практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами

4. почему этой проблемой стоит заниматься? • практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами - моделирование апоптоза у высших организмов

5. почему этой проблемой стоит заниматься? • практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами • моделирование апоптоза у высших организмов - моделирование феноптоза высших организмов (?)

6. зачем нужна запрограммированная смерть одноклеточных эукариотам?

7. зачем нужна запрограммированная смерть одноклеточных эукариотам? - при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым питаются остальные. Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism dies affects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232: Запрограммированная смерть Chlamydomonas reinhardtiiполезна для выживших, простой лизис - нет

8. зачем нужна запрограммированная смерть • одноклеточных эукариотам? • - при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым • питаются остальные. • Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism dies • affects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232: • Запрограммированная смерть Chlamydomonas • reinhardtiiполезна для выживших, простой лизис – нет • важно для паразитов: чтоб не убить хозяина слишком рано

9. зачем нужна запрограммированная смерть • одноклеточных эукариотам? • - при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым • питаются остальные. • Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism dies • affects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232: • Запрограммированная смерть Chlamydomonas • reinhardtiiполезна для выживших, простой лизис – нет • важно для паразитов: чтоб не убить хозяина слишком рано - очистка популяции от «слабых» (?)

10. клетка клетка клетка клетка Истощение среды роста Неблагоприятные условия Оторванная от коллектива Неблагоприятные условия В окружении других клеток “Альтруистическая смерть”

11. Слизевики У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб сытые споры Плодовое тело цАМФ смерть голодные “Альтруистическая смерть” Истощение среды роста Выяснение кто слабый Слабые жертвуют себя в пользу сильных Высокая плотность клеток

12. Как возникла запрограммированная смерть одноклеточных в процессе эволюции?

13. Как возникла запрограммированная смерть одноклеточных в процессе эволюции? «классический» апоптоз: - Сигнал (повреждение ДНК, гормон….) - Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий - Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства - цитохром с связывется сAPAF - APAF активирует каспазы

15. внутривидовая борьба • эгоистическая плазмида • токсин устойчивее ингибитора: смерть при снижении скорости белка, следовательно, смерть «слабых». Taylor-Brown and Hurd, Parasites & Vectors 2013, 6:108

17. Запрограммированная смерть почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae

18. Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей Saccharomyces cerevisiae • Образование АФК (активных форм кислорода) • Выход цитохрома с из митохондрий • Фрагментация ДНК на ранних этапах • Переход фосфатидилсерина из внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны • Чувствительность к ингибиторам синтеза белка • Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных : • метакаспаза • AIF 5 мкм Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п., а также хронологическое и репликативное старение

19. хронологическое и репликативное старение:

20. Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. - Хронологическое старение - модель старения высших организмов?

21. Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной • плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. • - Хронологическое старение - модель старения высших организмов? • много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной защиты, мутации по гомологам/ортологам апоптозных генов млекопитающих продлевали жизнь в этой модели

22. Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной • плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. • - Хронологическое старение - модель старения высших организмов? • много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной защиты, мутации по гомологам/ортологам апоптозных генов млекопитающих продлевали жизнь в этой модели но: • в воде живут годами

23. Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной • плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. • - Хронологическое старение - модель старения высших организмов? • много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной защиты, мутации по гомологам-ортологам апоптозных генов млекопитающих продлевали жизнь в этой модели но: • в воде живут годами • в среде со стабилизированным pH –тоже. все дело – в отравлении уксусной кислотой!

25. Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей Saccharomyces cerevisiae • Образование АФК (активных форм кислорода) • Выход цитохрома с из митохондрий • Фрагментация ДНК на ранних этапах • Переход фосфатидилсерина из внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны • Чувствительность к ингибиторам синтеза белка • Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных : • метакаспаза • AIF 5 мкм Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п., а также хронологическое и репликативное старение

26. альфа α α α Saccharomyces cerevisiae феромоны Альфа-фактор Было известно:большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей. Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти б

27. Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора АФКФазаФлоксин Б (мертвые клетки) -феромон +феромон мутантste20 + феромон

28. Насколько физиологична 100-кратная доза феромона? Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящего слияние клеточных стенок без добавок + хлорохин Окраска флоксином Б Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромонов достигают смертельных значений

30. Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1 Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад

31. Изучение механизма феромон-зависимой смерти: опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле. Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция Амиодарон, 80 мкМ «пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК) «миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи «ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель) Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?

32. FCCP + H Дыхательная цепь “протечка” АТФ-синтаза + H почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным?

33. Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997

34. Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий

35. Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном? олигомицин FCCP + H Дыхательная цепь “протечка” АТФ-синтаза + H

36. Концентрация кислорода Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны

37. Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS) FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает. Почему нокаут улучшает выживание?

38. реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку 10 мкм нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий

39. Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада - с помощью скринирования делеционной библиотеки 5 мкм Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий

40. почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти?

41. почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти? набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий

42. возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2 фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий? При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается

43. Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining Normal mitochondria network Depolarized mitochondria (dead cells) Mosaic staining JC-1 staining of amiodarone treated cells 11% WT 1% 88% Δysp2 35% 2% 63%

44. laser Laser hit experiments laser

45. Wild-type cells ysp2-delta cells A Before laser After laser ЛАЗЕР?? 5 min 10 min

46. Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте

47. Модель каскада феромон-зависимой смерти феромон рецептор амиодарон ∆ste20 подъем [Ca] в цитоплазме синтез белка циклогексимид подъем уровня сопряжения подъем ∆Ψ АФК Ysp1, Ysp2-зависимая фрагментация митохондрий падение ∆Ψ, выход цитохрома ц (1) (5) (6) (2) (1а) митохондрия низкий FCCP миксотиазол NAC, токоферол ∆ysp1, ∆ysp2 (7) (4) (3) (8) (9) (10) смерть клетки

48. Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997 как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?

49. использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации Б C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионыкласса SkQ)

50. использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации Б C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионыкласса SkQ)