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Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de la concentración de proteínas. Objetivos. Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína.
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Parte III. Monitoreo del proceso de purificación.A. Determinación de la concentración de proteínas
Objetivos • Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína. • Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína. • Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. • Determinar la concentración mediante la detección de la absorbancia a 280nm. • Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico: Determinación de proteínas por Bradford. • Analizar el progreso de la purificación de una proteína. • Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína: rendimiento y pureza. • Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.
Cómo monitorear un proceso de purificación? • Para evaluar de manera cuantitativa el éxito de una purificación de proteínas es necesario conocer dos parámetros: • el rendimiento y • el grado de pureza de cada paso del proceso de purificación.
El rendimiento • Parámetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad biológica de la proteína de interés en cada paso de la purificación. • El 100% corresponde a la actividad del extracto inicial.
Grado de pureza • Se refiere al incremento en pureza, valor que se obtiene de dividir la actividad específica de cada paso entre la actividad específica del paso inicial de purificación, este índice da el valor de 1 para el extracto inicial. • La actividad específica se expresa en Unidades/ mg proteína-1
¿Qué necesitamos hacer para construir nuestra tabla de purificación de la LDH? a) una técnica que determine la concentración de proteínas en la muestra, y b) una técnica que específicamente detecte o mida la cantidad de la proteína blanco (Unidades de actividad).
. Nishimune T et al. J. Nutr. 2000;130:1625-1628 ©2000 by American Society for Nutrition
Chromatofocusing of RGP-2 on mono-P. Potempa J et al. J. Biol. Chem. 1998;273:21648-21657 ©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Determinación de proteínas mediante un método no destructivo A 280 nm
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO ABS 280 NM. Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV. Leer la absorbancia las fracciones que te indique el profesor a la longitud de 280 nm.
Después.. • Usar el estimado para determinar las diluciones o alícuotas a usar en la determinación colorimétrica de proteínas. Recordar que la sensibilidad del Bradford es de 1 a 20 µg de proteína con una absorbancia máxima aproximada de 0.6. ¿porqué usar Bradford?
Determinación de proteínas por Bradford Construcción de curva patrón Determinación de proteínas de las muestras
Se utilizará una curva estándar de BSA • Añadir los reactivos en el orden mostrado, agitando después de cada adición. ¡Precaución, maneja con cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!. • Registrar la absorbancia a 595 nm. • Graficar absorbancia del estándar vs cantidad de proteína (g) y obtener los parámetros de regresión. 1000 uL
Calcular la concentración de proteína • Utilizar los parámetros de regresión obtenidos de la curva estándar, para calcular el contenido de proteína de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente fórmula: Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor de dilución de cada muestra. • El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra que utilizaste en el ensayo, obteniendo la concentración de proteína en µg/µL. • Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda que tienes duplicados para cada fracción.
