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  1. “Determinación comparativa, de especificidad y sensibilidad, de técnicas Inmunohistoquímicas Herceptest y Cerb2, en pacientes con cáncer de mama infiltrante; experiencia en laboratorio Histomed, Viña del Mar, Chile” Autores: Melissa Jiménez Onell Saúl Silva Miranda Profesor Guía: T. M. Francesca Norero Pineda Profesor Co Guía: Dr. Raúl González Álvarez Abril 2012

  2. 1. Marco Teórico 2. Objetivos 3. Materiales y Métodos 4. Resultados de la investigación 5. Discusión 6. Conclusiones 7. Bibliografía

  3. 1. Marco Teórico

  4. 1.1. Mama: Anatomía • El tejido glandular mamario esta constituido por 15 a 20 lóbulos, separados por tejido adiposo y formados por varios lobulillos. • (Geneser, 1987). • Compuestas de piel, tejido fibroadiposo, tejido glandular y tejido conjuntivo. • (Gonzáles et al, 2006). • Irrigación sanguínea: • Ramas de la arteria mamaria interna, torácica lateral, intercostales y tóraco-abdominal. • (Gonzáles et al, 2006). • Drenaje venoso: • venas intercostales, mamarias internas, ácigos. • (Lombardía y Fernández, 2007). • Drenaje linfático: • vía axilar (97%): 20 a 30 ganglios aproximadamente. • Grupo pectoral, interpectoral y apical. • Además vía mamaria interna y vías accesorias linfáticas. • (Lombardía y Fernández, 2007). “Atlas de Anatomía Humana Netter,1999” “Atlas de Anatomía Humana Netter,1999”

  5. 1.2. Mama: Histología • Lobulillos rodeados por estroma laxo, mixoide y con capacidad de responder al estimulo hormonal. • (Cotran et al, 2000). • Estroma fibroconectivo y tejido adiposo. • (Cotran et al, 2000). • Epitelio escamoso estratificado, Epitelio cilíndrico simple, Epitelio cúbico. • (Gonzáles et al, 2006) “http://www.uv.es/histomed/practicas/02-epglan/02-epglan.htm” “Atlas de histología Geneser,1985”

  6. 1.3. Mama: Patología Patología Benigna Neoplasias Benignas Neoplasias Malignas • Aplasia, amastia, macromastia, ginecomastia, mama ectópica, mastitis, ectasia ductal, esteatosis traumática, Ginecomastia. (Stevens, 2001) • Epiteliales: • adenoma, papiloma intraductal. • Fibroepiteliales: • Fibroadenoma, Cistosarcoma Filodes, Hamartoma, hiperplasias. • (Stevens, 2001) • Tumores Epiteliales No Invasivos: • Carcinoma lobulillar in situ • Carcinoma ductal in situ • Tumores Epiteliales Invasivos • Carcinoma lobulillar infiltrante • Carcinoma mucinoso o coloide • Carcinoma ductal infiltrante • (Stevens, 2001) Ginecomastia.“Histopatología básica, Wheater” Hiperplasia Ductal. “Histopatología básica, Wheater”

  7. 1.3.3. Neoplasias malignas Tumores epiteliales no invasivos Carcinoma ductal in situ Carcinoma lobulillar in situ • 80% incidencia. • Precursor de invasión, 30%. • No palpable (excepto comedo), multifocal. • Comedocarninoma, sólido, cribiforme, papilar y micropapilar. (Diaz y Ruibal, 2006) • 20% incidencia. • Ambas mamas, 50%-70% no palpable. • Células anillo de sello. • (Cotran et al, 2000) “Servicio de Anatomía Patológica del Hospital General Obispo Polanco 2010 “ “Histopatología básica, Wheater”

  8. 1.3.3. Neoplasias malignas Tumores epiteliales invasivos Carcinoma mucinoso o coloide Carcinoma ductal infiltrante Carcinoma lobulillar infiltrante • 10% incidencia. • Células pequeñas, uniforme. • Infiltración lineal, concéntrica. • Células con núcleo ovoide. • 2%. • Posmenopáusicas. • Blando, viscoso. • Bien diferenciado. • 79%. • Fibroso (escirroso). • Palpable, microcalcificaciones. • Invasión en cordones y masas. “Histopatología básica, Wheater” “Histopatología básica, Wheater” “Histopatología básica, Wheater”

  9. 1.4. Cáncer de Mama: Epidemiología Incidencia Mundial Incidencia Nacional • Neoplasia maligna mas frecuente en occidente. • 700.000 casos cada año. • 30% descenso en mortalidad. • Aumento 5% en países subdesarrollados. • 1995 inicio programa nacional cáncer de mama (pesquisa temprana). • Casos diagnosticados hasta año 2009: casos in situ (8.6%); casos estadios I-II de 46.7% a 69.4%; disminución de casos etapa IV en 72.2%.

  10. 1.4. Cáncer de Mama: Epidemiología • 2000-2009: disminución de 37.3% en casos de mujeres menores de 35 años; aumento de 15.4% en mujeres de 55 a 64 años; aumento de 43.2% en mujeres con más de 75 años.

  11. 1.4. Cáncer de Mama: Epidemiología Mortalidad • 1º causa mundial de muerte en la mujer. • Año 2008: en chile 2º lugar (14,5%) de muertes por cáncer en la mujer después del cáncer de vesícula y vías biliares. • Año 2008: Magallanes (22,7%), Viña del Mar-Quillota (20,6%), Valparaíso-San Antonio(18,6%), mayor mortalidad.

  12. 1.5. Cáncer de Mama: Factores de riesgo • Para identificar grupos de alto riesgo. (Burke et al, 2003) • Clasificación: 1. Factores no genéticos. 2. Hormonas Exógenas. 3. Factores dietéticos. 4. Radiaciones ionizantes. 5. Tabaquismo. 6. Lesiones Precursoras Previas. • Hiperplasias epitelial • Hiperplasia ductal típica(Cancer risks in BRCA2 mutation Carriers, 1999). • Hiperplasia ductal atípica: simula CDIS (Krieger et al, 1992). • Lesiones lobulillares • hiperplasia lobulillar atípica (4 veces mas riesgo) (Page et al, 1985). • carcinoma lobulillar in situ (10 veces mas riesgo) (Connolly et al, 1993).

  13. 1.5. Cáncer de Mama: Factores de riesgo • 7. Factores Genéticos Genes BRCA 1/BRCA2: • BRCA1 mutado en 1% de población general (Newman et al, 1998) y en 20%-30% de población de alto riesgo (Couch et al, 1997). • BRCA1 mutado  87% frecuencia Cáncer de mama (Ford et al, 1995) . • BRCA2 mutado  84% frecuencia Cáncer de mama (Ford et al, 1998) . • BRCA1 mutado y diagnóstico previo de cáncer de mama con riesgo de segundo primario(40%-65%). (Easton et al, 1995) • BRCA2 mutado y diagnóstico previo de cáncer de mama el riesgo es de 50%. (Cancer risks in BRCA2 mutation Carriers, 1999)

  14. 1.6. Cáncer de Mama: Diagnóstico y Tratamiento Diagnóstico Nivel primario: examen físico, mamografía y ecotomografía. Nivel secundario(UPM) : histopatología (biopsia). Nivel terciario: comité oncológico para evaluación tratamiento. (MINSAL,2011). http://www.clinicadam.es/temas-de-salud/imagenes/17016.html Tratamiento 1.Terapia locorregional:Cirugía conservadora, Cirugía no conservadora y Radioterapia. (Sánchez et al, 2008). 2. Terapia sistémica: Quimioterapia, Hormonoterapia (anti estrógenos, progestágenos e inhibidores de la aromatasa). (MINSAL,2011). http://mastologica.com/htmls/CO.html http://es.globedia.com/test-genetico-permite-identificar-pacientes-beneficiaran-quimioterapia-cancer-mama

  15. 1.7. Cáncer de Mama: factores pronósticos y predictivos • Factores Pronósticos : Características del tumor utilizados para predecir la historia natural de la neoplasia, recidiva y sobrevida de las pacientes (Pérez et al, 2008) en ausencia de un tratamiento adyuvante (Domínguez et al, 2001). • Factores Predictivos : Respuesta o falta de respuesta a un tratamiento en particular (Hurtado et al, 2004). Categoría I: tamaño tumoral, afectación ganglionar (axilar, centinela, supraclaviculares y mamaria interna), micro-metástasis, tipo histológico, grado histológico (Elston y Ellis), clasificación tumoral (TNM), receptores hormonales. Categoría II: Her2, P53, invasión vascular y linfática, Ki67. Categoría III: Ploidía, catepsina D, angiogénesis, EGFr, Bcl-2, PS2.

  16. 1.8. Cáncer de Mama: receptores hormonales • Fisiología mamaria regulada por estimulo hormonal; estrógenos (crecimiento ductal) y progesterona (desarrollo lobulillar). (Díaz-Faes y Ruibal, 2006) • Proteínas de superficie nuclear (receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP). (Bellido, 1999) • REα: en mama, útero, ovarios. • REβ: ovario, endotelio. (Noriega y Langley, 2008) • Funciones: estimulación mitosis y diferenciación mamaria, respectivamente. • 15-30% de expresión de REα en células epiteliales mamarias. • REβ en células estroma mamario. • RPA y RPB: modificación células del estroma mamario. (Malgor y Valsecia) http://wdict.net/es/gallery/receptor+de+estr%C3%B3geno/ Bottino y Lanari, 2010

  17. 1.8. Cáncer de Mama: receptores hormonales y cáncer de mama • 55%-65% de canceres primarios y 45%-55% de metástasis son positivos a marcación de RE . (Hurtado et al, 2004) • 45%-60% canceres primarios y metástasis son RP positivos. • Expresión positiva RE : Buen pronóstico (Monroy, 2002), mejor diferenciados. • Expresión negativa RE: Mal diferenciados, mayor recurrencia. • Pacientes RE+/RP+ : 77% responde a tratamiento. • Pacientes RE+/RP- : 27% responde a tratamiento. • Pacientes RE-/RP+ : 46% responde a tratamiento. • Pacientes RE+/RP+ : 11% NO responde a tratamiento. (Cammarata, 2008)

  18. 1.9. Oncogén Her2: Biología y Expresión celular de Her2 • Her2/neu(ERBB2): Oncogén identificado por transfección de etilnitrosourea a células de neuroblastoma. • Ubicación en cromosoma 17 q21. • Codifica proteína transmembrana. • Dominio extracelular (unión a FC). • Dominio intracelular con actividad tirosin-quinasa (fosforilación). (Bargmann et al, 1986) • Dimerización de proteína activa fosforilación. (Hynes y Lane, 2005)

  19. 1.9. Biología y Expresión celular de Her2 • cADN de oncogén neu: codifica proteína transmembrana semejante a proteína de oncogen v-erb-b (EGFR), de ahí su denominación c-erb-2 o HER2. (Yamamoto et al, 1986) • Familia de receptores EGFR: HER-1, HER-3, HER-4, pero desconocido HER-2. • HER2 se activa por formación de heterodímeros (mayor estimulación celular que homodímeros). (Ross et al, 1999) (Ross et al, 1999)

  20. 1.9. Significado biológico de la activación de Her2 en cáncer de mama • 1897 por Slamon y cols lo asociaron con tiempo de recaída y sobrevida libre de la enfermedad. • Amplificado en 20%-30% de cánceres. • Amplificación génica de her2/neu en: tumor agresivo, resistencia a quimioterapia y terapia hormonal, asociado a pronósticos desfavorables (Slamon et al ,1989) • Peor pronóstico en metástasis ganglionares. • Valoración de tumores sensibles a Adriamicina, resistentes a Tamoxifen y derivación a trastuzumab (Naber et al, 1990). http://www.dfarmacia.com/farma/ctl_servlet?_f=37&id=13034839

  21. 1.9. Significado biológico de la activación de Her2 en cáncer de mama • Evolución en detección de nuevos marcadores: Proto-oncogén Her2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor-2). • Relación inversa con expresión de RH: 29,4% amplificación  RE-/RP- ; RE+/RP- (Medicina UPB, 2010) • Amplificación Her2  49,1% RE + • Sin amplifiación Her2  78,17% RE + • (Lal et al, 2005) • Amplificación Her2  24,3% RP + • Sin amplificación Her2  53,1% RP + • (Lal et al, 2005) “HER2-Positive Breast Cancer: Current Standards and Future Directions. (Khan, 2006) vol 1. Num 1”

  22. 1.9. Significado biológico de la activación de Her2 en cáncer de mama Otras técnicas de identificación: • Sourthern blot, Spot blot, PCR, IHQ (Inmunohistoquímica), FISH (hibridación fluorescente in situ) y CISH (hibridación cromogénica in situ). • FISH y CISH, morfología y sobrexpresión, sensibilidad 98% y especificidad 100%. • El exceso de copias gen HER2, da un aumento de ARNm y finalmente aumento de proteínas codificadas por HER2. • Por lo anterior, estudio ADN, ARNm o proteínas. (Hanna et al, 1999) • Métodos aprobados por la FDA: IHQ (proteína), FISH (amplificación gen) (Medicina UPB, 2010)

  23. 1.10. Trastuzumab (Herceptin) • Anticuerpo monoclonal tipo IGGI Kappa con región susceptible de actuar como ligando del receptor para HER2. • Estimula sistema inmune de la paciente. • Bloquea los receptores her2 impidiendo su unión a los factores de crecimiento epidermal (EGF). • Aprobado en 1998 por la FDA. • Administración por 12 meses. • Mejora pronóstico, sobrevida, reduce recidivas. • Denis Slamon año 2001 estudió beneficio de terapia con Trastuzumab y quimioterapia: 50% mayor respuesta, 22% menos muertes en un 1 año. • Piccart año 2005 estudió adyuvancia Herceptin luego de quimioterapia, disminución 50% recurrencia.

  24. 1.11.Técnicas de detección Her2: Inmunohistoquímica Técnica Cerb2 Técnica Herceptest Dako • Ensayo semicuantitativo. • Anticuerpo primario monoclonal anti oncoproteína her2 humano (Dako. pharmDx™ Kit). • Anticuerpo diluido 1:50 en buffer PBS • Tejido fijados en formalina y embebidos en parafina. • Interpretación del resultado de la muestra se basa en la intensidad de la tinción, el porcentaje de células marcadas y continuidad de tinción de la membrana. • Derivación a tratamiento con Herceptin (Trastuzumab). • Ensayo semicuantitativo. • Anticuerpo primario policlonal anti oncoproteína Her2, conjugado Her2-Her1 y conjugado Her2-Her3, humano (Dako. pharmDx™ Kit). • Anticuerpo diluido 1:50 en buffer PBS. • Tejido fijados en formalina y embebidos en parafina. • Interpretación del resultado de la muestra se basa en la intensidad de la tinción, el porcentaje de células marcadas y continuidad de tinción de la membrana.

  25. 1.11. Técnicas de detección Her2: Inmunohistoquímica

  26. 1.11. Técnicas de detección Her2: Inmunohistoquímica http://latestbreastcancer.blogspot.com/2011/05/her2-part-4-how-doctors-determine-if.html

  27. 1.12. Hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detección de Her2 • Determinación cuantitativa de amplificacion de gen Her2. • Casos derivados a tratamiento con herceptin (2+, 3+). • sonda CEN-17 PNA marcada con fluoresceína (verde). • sonda de ADN Her2 marcada con un fluorocromo (rojo). • Los resultados de FISH: NA: no amplification; LA: low amplification y HA: high amplification.

  28. 1.12. Comparación FISH e IHQ Estudio de 360 casos año 2004 Mrozkowiak et al (Arena et al, 2010) : Casos 0/1+ : sin amplificación. Casos 3+ : 90% con amplificación de Her2. Casos 2+ : mayor diferencia, 80% sin amplificación. http://www.dako.com/28633_04may10_herceptest__brochure-9086.pdf

  29. 2. Objetivos

  30. 2.1. Objetivo General Comparar, a partir de un estudio estadístico, la especificidad y sensibilidad de cada técnica Inmunohistoquímica, utilizada para el diagnóstico en muestras de pacientes con carcinoma de mama infiltrante en laboratorio Histomed, Viña del Mar.

  31. 2.2. Objetivos específicos Estandarizar protocolos Herceptest y Cerb2 a un modo cerrado, manteniendo su calidad y reproducibilidad. Permitiendo realizar el estudio comparativo en condiciones similares. Relacionar sensibilidad (intensidad) con especificidad (marcaje), de cada reacción Inmunohistoquímica, de tal manera encontrar si son proporcionalmente similares en su expresión. Interpretar la sensibilidad y especificidad de Herceptest y cerb2, en condiciones similares para la expresión de Her2. Examinar la expresión de estrógeno versus progesterona en patología infiltrante mamaria, bajo perspectiva de la expresión de Her2. Establecer el mejor resultado según el número de pacientes candidatas a tratamiento efectivo basados en resultados de Cerb2 y Herceptest. Analizar datos sobre patologías mas frecuentes, rangos edad de incidencia y metástasis, en presencia de expresión de Her2.

  32. 3. Materiales y Métodos

  33. 3.1. Materiales • Dependencias laboratorio Histomédica Ltda., el cual consta con implementación requerida para realizar técnicas Inmunohistoquímicas. • Kit de técnicas Inmunohistoquímicas Herceptest y Cerb2 suministrados por el laboratorio patrocinador. • 107 muestras, correspondientes a pacientes del año 2009 a 2011, en rango de edad entre 31 y 87 años, con asistencia médica en el Hospital Gustavo Fricke, de Viña del Mar, que presentan patología cancerígena infiltrante mamaria.

  34. 3.1. Materiales Obtención de datos/muestras: Selección muestras 70 muestras correspondientes al 65,42% del total de casos presentados serán evaluadas en este estudio estadístico comparativo. Siendo descartadas 37 muestras ligadas al 34,58% del total presentado, las cuales son casos de carcinoma in Situ, que se realizaron a petición del médico Oncólogo. • Criterios de inclusión Muestras obtenidas por tumorectomía o mastectomía de pacientes con diagnóstico de carcinoma infiltrante de mama. • Criterios de exclusión Muestras de pacientes obtenidas por biopsias Core y aquellas con diagnóstico de carcinoma In situ, además de patologías asociadas que ocasionen falsos positivos como la hepatitis tipo B.

  35. 3.2. Método Procesamiento de muestras Fijación. Procesamiento. Inclusión. Corte. Tinción. Técnica IHQ: Herceptest – Cerb2.

  36. 3.2. Método • Evaluación presencia receptores hormonales

  37. 3.2. Método • Evaluación presencia receptores hormonales

  38. 3.2. Método Evaluación presencia proteína Her2 Cerb2 y Herceptest: campo de 20x 0: negativo, no se observa coloración de membrana o esta sólo se encuentra en menos del 10% de las células. 1+: negativo, coloración de membrana débil e incompleta en menos del 10% de las células. 2+: débilmente positivo (dudoso) coloración de membrana de mediana intensidad e incompleta de membranas en más del 10% de las células. 3+: fuertemente positivo, tinción fuerte y continúa de membrana en más del 10 % de las células. • Además se considera un rango de error de un 5% para el diagnóstico de intensidad y continuidad de membrana, por la subjetividad de cada observador, para precisar este dato, se establece una cantidad de 4 observadores.

  39. 3.2. Método • Selección variables estudio • Los parámetros establecidos para el estudio son: • Edad. • Sexo. • Porcentaje ganglios linfáticos que presentan metástasis. • Diagnóstico. • Receptores de Estrógeno (RE): marcaje. • Receptores de Progesterona (RP): marcaje. • Herceptest: marcaje, intensidad, continuidad de membrana. • Cerb2: marcaje, intensidad, continuidad de membrana. • Metodología para análisis de datos • 1. Estudio individualizado por cada técnica inmuhistoquímica. • 2. Estudio de relaciones entre parámetros de cada técnica Inmunohistoquímica. • 3. Estudio diagnóstico predictivo, para pacientes con posibilidad de tratamiento con Herceptin. • 4. Promedio y frecuencia de datos anexos. Estudio validados con ANOVA para datos dependientes y CHI2 para datos independientes, realizados en software STATA.

  40. 4. Resultados de la investigación

  41. 4.1. Herceptest Score + Score - Score ++ Score +++

  42. 4.1. Herceptest

  43. 4.1. Herceptest

  44. 4.2. Cerb2 Score + Score - Score ++ Score +++

  45. 4.2. Cerb2

  46. 4.2. Cerb2

  47. 4.3. Resumen técnicas IHQ para Her2

  48. 4.3. Resumen técnicas IHQ para Her2

  49. 4.4. Datos Anexos al estudio

  50. 4.4. Datos Anexos al estudio