slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Cag: Un T4SS peu orthodoxe PowerPoint Presentation
Download Presentation
Cag: Un T4SS peu orthodoxe

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 35

Cag: Un T4SS peu orthodoxe - PowerPoint PPT Presentation


  • 108 Views
  • Uploaded on

Cag: Un T4SS peu orthodoxe. Pathogénicité de H. pylori. La virulence de H. pylori est basée sur un ensemble de mécanismes, dont un système de sécrétion de type IV. Rappels sur les T4SS. 3 sous-familles:. Rappels sur les T4SS. VirB/D4: un système modèle.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Cag: Un T4SS peu orthodoxe' - jersey


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide2

Cag:

Un T4SS peu orthodoxe

slide3

Pathogénicité de H. pylori

La virulence de H. pylori est basée sur un ensemble de mécanismes, dont un système de sécrétion de type IV.

slide4

Rappels sur les T4SS

3 sous-familles:

slide5

Rappels sur les T4SS

VirB/D4: un système modèle

slide7

Le T4SS Cag de H. pylori

Codé par 18 gènes regroupés en un îlot de pathogénicité.

Appareillage de sécrétion: 14

Facteurs de translocation: 4

1 seul effecteur sécrété: CagA

slide9

Rôle du Nter et du Cter?

Construction de fusion GFP-hemiCagA

Expression dans

H. pylori ΔcagA

Infection de cellules AGS

Microscopie à épifluorescence

Pas de GFP dans les cellules AGS

Peut être que la GFP est trop volumineuse pour le système Cag?

slide10

Rôle du Nter et du Cter?

Même expérience chez H. pylori wt

Observer l’effet sur la sécrétion de CagA

GFP-’CagA bloque la sécrétion de CagA car la GFP obstrue le T4SS

’CagA-GFP ne bloque pas la sécrétion de CagA car il n’est pas recruté au T4SS

La moitié Cter de CagA porte les informations de recrutement au T4SS

slide11

In vivo

In vitro

Affiner le résultat précédent…

Construction de variants

de CagA raccourcis en Cter

Expression dans

H. pylori ΔcagA

Infection de cellules AGS

Une délétion des 20 aa Cter de CagA abolit la Tyr-phosphorylation in vivo mais pas in vitro.

Les mutants de délétion ne sont donc pas injectés dans les cellules AGS

L’extrémité Cter de CagA contient des informations

nécessaire à la translocation de type IV

slide12

CagAK1203L 1208I

CagAK1203I 1208L

Comparaison avec d’autres effecteurs de type IV

Pas de motif conservé, présence de résidus Lysine potentiellement importants

Mutation ponctuelle des lysines 1203 et 1208

La protéine CagA mutée est toujours sécrétée

Les charges + du Cter ne sont pas nécessaires pour la sécrétion de CagA.

slide13

Echangeabilité des séquences Cter

Ajout à CagAΔ20C de séquences Cter d’autres protéines sécrétées par le T4SS

Il existe bien un signal commun pour la sécrétion de type IV, mais celui de CagA ne repose pas sur la charge électrique de la région Cter.

slide14

Et la région Nter?

Construction de variants de CagA raccourcis en Nter

Les protéines présentant de petites délétions en Nter ne sont produites qu’en très petites quantités

Construction de variants de CagA amputés de segments plus longs.

Aucun des variants délétés en Nter n’est Tyr-P in vivo, alors qu’ils le sont in vitro.

Ces variants ne sont donc pas injectés dans les cellules AGS

La région Nter de CagA contient des informations nécessaires à la sécrétion par le T4SS

slide15

La protéine CagA de H. pylori présente des signaux nécessaires à sa sécrétion par le T4SS qui sont originaux par rapport aux autres effecteurs de type IV.

slide16

N

C

La versatilité des T4SS se reflète à la fois dans la diversité des effecteurs transportés et dans les différents mécanismes de reconnaissance de ces effecteurs.

Nter (sec dépendant)

ex: DotA L.pneumophilia

Cter, charge +

ex: VirD5 A.tumeaciens

Cter, hydrophobique

ex: RalF L.pneumophilia

Entrée dans le T4SS via le périplasme

Cter

ex: CagA H.pylori

Domaine Nter

ex: CagA H.pylori

Domaine Cter

ex: Bep B.henselae

slide17

Malgré leur extrême variabilité, les extrémités Cter des différents effecteurs de type IV sont échangeables.

Cela suggère qu’au moins une partie du mécanisme de reconnaissance est commune aux différentes espèces utilisant ce mécanisme de sécrétion.

Étant donné la diversité des séquences mises en jeu, il est probable que le signal de translocation de type IV implique des caractéristiques structurelles (secondaires ou tertiaires).

slide18

La présence chez CagA d’un domaine Nter nécessaire à la translocation par le T4SS a plusieurs explications possibles:

CagA serait chaperonnée par une protéine se fixant en Nter (à l’instar de VirE2 et de sa chaperonne VirE1).

Stabilisation de la protéine lors de sa translocation

Une translocation en 2 étapes, nécessitant d’abord les signaux en Cter (reconnaissance et adressage au T4SS), puis ceux en Nter (translocation et traversée du pseudo-pilus)

slide19

On sait à présent que CagA porte des signaux de translocation situés à son extrémité Cter ainsi que dans sa région Nter.

Par quels mécanismes CagA est elle adressée à la machinerie de sécrétion?

slide20

A l’heure actuelle il est généralement supposé que la Coupling Protein serait capable de reconnaître les effecteurs à sécréter.

Parmi les 4 gènes ’’accessoires’’ du PAI Cag on trouve notamment:

cagβ: code pour une protéine homologue à VirD4

cagF: code pour une protéine qui interagit avec CagA

slide21

Importance de CagF pour la translocation de CagA

Une souche ΔcagF ne sécrète plus CagA, mais induit toujours une réponse IL-8

cagF ne serait donc pas un composant du T4SS mais serait un facteur essentiel à la translocation de CagA?

Utilisation de la souche P12: cause une réponse IL-8 partielle si il n’y a pas sécrétion de CagA

Étude de la réponse IL-8 de cellules AGS infectées par des mutants ΔcagF et ΔcagY de H. pylori P12

Les mutants ΔcagF et ΔcagA présentent un phénotype similaire.

slide22

Importance de CagF pour la translocation de CagA

Étude de la translocation de CagA par les mutants ΔcagF

CagF est un facteur nécessaire à la translocation de CagA

slide23

CagF est-elle co-sécrétée avec CagA?

Construction de fusion GSK-CagF et GSK-CagA (le tag GSK est phosphorylé dans les cellules Eucaryotes).

GSK-CagF n’est pas phosphorylé invivo, mais l’est in vitro.

Donc GSK-CagF n’est pas injectée dans les cellules AGS.

CagF n’est pas co-sécrétée avec CagA.

slide24

Qui interagit avec CagA?

Immunoprécipitation de CagA à partir de souches WT, ΔcagA, et ΔPAI-[cagA]

La protéine qui co-précipite majoritairement avec CagA est CagF.

slide25

Qui interagit avec CagA?

Étude de l’interaction CagF-CagA dans les mutants ΔcagV; ΔcagI; ΔcagZ et Δcagβ

Les délétions des facteurs de translocation ou d’éléments de la machinerie du T4SS ne semblent pas affecter la capacité de CagF à co-précipiter avec CagA.

CagF est la protéine qui interagit majoritairement avec CagA, et ce indépendamment des autres éléments du PAI cag.

slide26

Localisation de CagF?

Analyse du contenu des fractions cellulaires

CagF semble être à la fois dans les phases membranaires et hydrosolubles.

CagF solubilise dans les mêmes conditions que Cagα qui est une protéine associée à la membrane cytoplasmique.

ComB8 (une protéine intégrale de membrane cytoplasmique) ne solubilise pas dans ces conditions.

slide27

CagF-GFP

GFP

Localisation de CagF?

Observation au microscope confocal de H. pylori exprimant la fusion CagF-GFP

CagF peut être trouvée dans le cytoplasme des cellules ou associé à la face cytoplasmique de la membrane interne.

slide28

Adressage de CagA à la membrane?

Co-immunoprécipitation de CagA dans les différentes phases cellulaires:

CagF ne co-purifie avec CagA que dans la phase membranaire.

CagF est peut etre responsable de l’adressage de CagA à la membrane?

CagA est adressée à la membrane en l’absence de CagF, et inversement

CagF n’est pas nécessaire à l’adressage de CagA à la membrane interne.

slide29

Stoechiométrie de l’interaction CagA-CagF?

Les données réunies jusqu’ici pointent vers une fonction de chaperonne pour CagF.

Les chaperonnes des T3SS agissent généralement en dimères.

CagF serait capable de former des dimères, en solution pure ou en interaction avec CagA

slide30

Zone d’interaction CagF-CagA?

Construction de différents variants de CagA

On teste ensuite l’interaction de ces variants avec la protéine GST-CagF fixée sur des billes Glutathion-Sépharose (GST pulldown).

slide31

Zone d’interaction CagF-CagA?

CagF se fixe à la partie Cter de CagA, entre les résidus 1019 et 1123

slide32

Adressage de CagA au T4SS

Le domaine de liaison à CagF est il nécessaire au recrutement de CagA par le T4SS?

Construction de fusion entre la GFP et le Cter de CagA.

On cherche à observer l’obstruction du T4SS par la GFP

Seule la protéine de fusion portant la totalité du site de fixation de CagF bloque la sécrétion de CagA

Le site de fixation de CagF est donc essentiel à l’adressage de CagA à la machinerie de sécrétion de type IV.

slide33

Comme VirE2, la translocation de CagA par le T4SS nécessite la présence d’une protéine chaperone-like.

Plusieurs données indiquent que CagF remplis cette fonction:

*Comme VirE1, CagF présente des caractéristiques proches de celles des chaperonnes de type III (PI acide; fort pourcentage d’hélices α).

*CagF est nécessaire à la translocation mais ne fait pas partie du mécanisme de sécrétion.

*Comme la plupart des chaperonnes de type III, CagF est capable de former des homodimères en se fixant à CagA.

*CagF aurait un rôle dans l’adressage de CagA au T4SS.

slide34

Mais CagF présente aussi des caractéristiques originales:

*CagF est une protéine associée à la membrane interne, alors que les chaperonnes (dont VirE1) sont cytosoliques.

*VirE1 assure la stabilité de VirE2, alors que CagF n’a pas d’effet sur la stabilité de CagA.

La fonction exacte de CagF est encore inconnue:

*CagF pourrait modifier la conformation de CagA afin de faciliter son transfert

*CagF pourrait faciliter la reconnaissance du signal de translocation Cter

*CagF pourrait recruter CagA au niveau de la machinerie de sécrétion

slide35

M.E

M.I

N

N

C

C

N

Modèle proposé

CagF

CagA