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Hepatitis B Oculta

Hepatitis B Oculta. Diego Flichman Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires dflichman@ffyb.uba.ar. "Programa de Educación Permanente" de la Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunohematología 28 de Agosto de 2013. Relevancia de HBV.

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  1. Hepatitis B Oculta Diego Flichman Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires dflichman@ffyb.uba.ar "Programa de Educación Permanente" de la Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunohematología 28 de Agosto de 2013

  2. Relevancia de HBV • Mas de 350 millones de personas infectadas en el mundo (> 5%). • Incidencia anual ~ 50 millones de casos. • B. Agente causal de ~ 600,000 muertes por año. • C. El 70-90% de las infecciones perinatales evolucionan a la cronicidad. • D. En áreas de África y el este asiático 50% de la población es seropositiva, 5 - 15 % infectada crónicamente. • E. Los portadores tienen una probabilidad 200 veces mayor de desarrollar hepatocarcinoma. • F. Es el agente causal del ~80 % de los hepatocarcinomas en el mundo.

  3. Estructura Glicoproteía HBsAg Core HBcAg P Polimerasa Genoma 3,2 kb ADN parcialmente doble cadena de circular laxo Envoltura

  4. P P P P Adsorción Liberación de nucleocápsides Antígenos Anticuerpos HBsAg anti-HBs HBeAg anti-HBe anti-HBc RT Liberación del genoma pgmRNA pCmRNA cccADN S mRNA Reparación Transcripción X mRNA

  5. 4 Marcos de lectura preS2 preS1 S2 prom S S1 prom 7 Proteinas Polymerase 2 Enhancers - + Core 4 Promotores BCP Enh I X prom Enh II pC X Organización genética HBV ADN ARNm SL ARNm SM Genoma: ADN parcialmente doble cadena de 3,2 kb circular laxo

  6. Curso serológico HBV-ADN HBsAg - antiHBc + HBV-ADN - Infección resuelta HBsAg Total anti-HBc IgM anti-HBc Anti-HBs HBV-ADN Título Título HBsAg - antiHBc +/- HBV-ADN + ? HBsAg + antiHBc + HBV-ADN + Infección crónica HBsAg Total anti-HBc IgM anti-HBc años años 0 0 4 4 8 8 16 16 20 20 24 24 28 28 36 36 12 12 32 32 52 52 Semanas post exposición Semanas post exposición En su interacción con el hospedador el virus explora todos los caminos posibles con la finalidad de permanecer en la naturaleza

  7. Reseña historica

  8. HBV oculta (OBI) HBV-ADN en hígado Seropositiva HBsAg negativo antiHBcpositivo antiHBspositivo/ negativo antiHBepositivo/ negativo Seronegativa HBsAg negativo antiHBc negativo antiHBs negativo antiHBe negativo HBV-ADN en suero <103 copias/ml HBsAg No se produce Se produce en concentraciones no detectables Se produce una variante no detectable por los métodos convencionales Virus Hospedador

  9. Interrogantes Cuál es la frecuencia de ocurrencia de la OBI? Cuál es la frecuencia de hepatitis post-transfusonal a partir de OBI? Cómo diagnosticar la OBI? Cuales son los mecanismos que conllevan a OBI? • Prevalencia de HBV en la región • Población en estudio • 1.1. Grupos de riesgo • 1.2. Coinfectados con otros agentes virales (HCV, HIV) • 1.3. Donantes de sangre 2.1. Estado inmunológico del receptor 2.2. Nivel de anti-HBs 3.1. Metodología para la detección 4.1. Mutaciones y deleciones en el genoma viral 4.2. Coinfecciones con otros agentes virales 4.3. Respuesta inmune del hospedador 4.4. Cambios epigenéticos

  10. 1. Cuál es la frecuencia de ocurrencia de la OBI? • Prevalencia de HBV en la región • Población en estudio • 1.1. Grupos de riesgo • 1.2. Coinfectados con otros agentes virales • 1.3. Donantes de sangre Coinfectados HCV 15-33% Coinfectados HIV 10-45% Hepatitis criptogénica 32 % Dializados 27% Hepatocarcinoma 62% Cacciola I, N. Engl. J. Med. 1999 Gupta S, 2010. BMC Infect. Dis. 2010 Chan HL, Am. J. Gastroenterol 2002 Di Stefano M, J. Nephrol. 2009. Hassan ZK, Virol. J. 2011

  11. Frecuencia en coinfectados con HCV 250 pacientes con hepatitis crónica (HBsAg negativo) 200 anti-HCV + Biopsias de hígado <0.001 <0.001 n:73 Anti-HCV Anti-HBc 45 de las 73 ADN-HBV+ en suero HBV-ADN + en hígado 29% HBV-ADN + en suero 18% • Occult hepatitis B virus infection in patients with chronic hepatitis C liver disease. Cacciola I. N Engl J Med1999.

  12. Frecuencia en coinfectados con HIV 2071pacientes 57 anti-HBc (33 anti-HCV) 51 HBV-ADN 89.5% Sin tratamiento 3,5 muestras/paciente Nested PCR de 2 regiones (Core y S) 1123 pacientes 160 anti-HBc 1 HBV-ADN 100 tratados con ATV (LAM/TFV) 1 muestra/paciente COBAS Amplicor HBV Monitor (200 cp/ml) 15 persistente (26.3%) 36 intermitente (63.2%) • Frequent chronic hepatitis B virus infection in HIV-infected patients positive for antibody to hepatitis B core • antigen only. Swiss HIV Cohort Study. Hofer M, Eur J ClinMicrobiol Infect Dis1998. • Occult hepatitis B virus infection in HIV-infected patients with isolated antibodies to hepatitis B core antigen: • Aquitaine cohort, 2002-2003. Neau D, Clin Infect Dis. 2005.

  13. Frecuencia en donantes de sangre 3.405.497 donantes 197 HBsAg- /HBV-DNA+ 8 período ventana (2001-2006) 189 OBI (0.055‰) (10-24) anti-HBc + 43 189 casos anti-HBs + anti-HBe + 146 anti-HBc + anti-HBc + anti-HBs + 64 (74.5%)  10 mIU/ml anti-HBs 22 (25.5%) < 10 mIU/ml anti-HBc + anti-HBe + • Impact of nucleic acid testing for hepatitis B virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus on the • safety of blood supply in Italy: a 6-year survey. Velati C, Transfusion 2008.

  14. 2. Infección de HBV por transfusión de OBI • Type B hepatitis aftertransfusionwithbloodcontainingantibodyto hepatitis B coreantigen. Hoofnagle JH, N Engl J Med. 1978. • A Europeanperspectiveonthemanagement of donors and unitstesting positive for hepatitis B virus DNA. Allain JP, Transfusion 2006. • Transmission of occult hepatitis B virus bytransfusiontoadult and pediatricrecipients in Taiwan. Liu CJ, J Hepatol. 2006. • Infectivity of bloodcomponentswithlow hepatitis B virus DNA levelsidentified in a lookbackprogram. Satake M, Transfusion 2007. • HBsAg non-reactive HBV infection in blooddonors: transmission and pathogenicity. Gerlich WH, J Med Virol 2007. • Anti-HBs positive occult hepatitis B virus carrierbloodinfectious in twotransfusionrecipients. Levicnik-Stezinar S, Hepatol. 2008.

  15. 2. Infección de HBV por transfusión de OBI 14 donaciones previas y 1 posterior no fueron infectivas Detectable por métodos in housepero no por métodos comerciales 2 muestras negativas • Anti-HBs positive occult hepatitis B virus carrierbloodinfectious in twotransfusionrecipients. Levicnik-Stezinar S • Hepatol. 2008.

  16. 3. Cómo diagnosticar la OBI? • Metodología para la detección • Nested PCR con elevado limite de sensibilidad • Diferentes regiones del virus (PreCore, Polimerasa, gen X) • Muestras secuenciales (viremia intermitente en OBI) • Muestra analizada (tejido hepático vs suero) • Sensibilidad de los kits de HBsAg • Reactivity of 13 in vitro expressed hepatitis B surfaceantigenvariants in 7 commercialdiagnosticassays. Ireland JH, Hepatology. 2000.

  17. 3. Cómo diagnosticar la OBI? • Metodología para la detección • Nested PCR con elevado limite de sensibilidad • Diferentes regiones del virus (PreCore, Polimerasa, gen X) • Muestras secuenciales (intermitente en la viremia puede ocurrir en OBI) • Detección en tejido hepático (biopsias) • Sensibilidad de los kits de HBsAg • Reactivity of 13 in vitro expressed hepatitis B surfaceantigenvariants in 7 commercialdiagnosticassays. Ireland JH, Hepatology. 2000.

  18. 4. Mecanismos que conllevan a OBI? 4.1. Mutaciones y deleciones en el genoma viral 4.2. Coinfecciones con otros agentes virales 4.3. Respuesta inmune del hospedador 4.4. Cambios epigenéticos

  19. 4.1. Mutaciones y deleciones en el genoma viral S • Mutaciones en el determinante “a” (Falsas OBI, generalmente HBV-ADN >104 copis/ml) • Mutaciones asociadas a tratamiento con análogos S1 Spacer S2 C C C C Terminal Protein 833 G F A B C D E Determinante a 137 147 139 G145 Envoltura Polimerasa Afinidad (IC50 µg/ml) Wild type Wild type 1 G145R W153Q >55.0 D144E/G145R G153E >55.0 F158Y F166L 1.86 E164D V173L 14.86 W196S M204I 8.29 I195M M204V 5.26 M198I V207I 12.50 E164D/I195M V173L//L180M/M204V 54.53 HBsAg NH2 I III IV II V Nucleocapside COOH RT TP RH HBV-DNA • Molecular genesis of drug-resistant and vaccine-escape HBV mutants. Locarnini SA, AntivirTher 2010. • HBV transmissionfromanoccultcarrierwithfivemutations in themajorhydrophilicregion of HBsAgtoan • immunosuppressed plasma recipient. Coppola N. J Clin Virol. 2013.

  20. 4.1. Mutaciones y deleciones en el genoma viral • Mutaciones en el determinante “a” (Falsas OBI, generalmente HBV-ADN >104 copis/ml) • Mutaciones asociadas a tratamiento con análogos • Mutaciones en el promotor del gen S 591 HBsAg negativo  56 HBV-ADN positivo  9 secuenciados GC • Occult hepatitis B virus infection in chronicliverdisease: full-lengthgenome and analysis of mutantsurface • promoter. Chaudhuri V, Gastroenterology. 2004.

  21. P 4.1. Mutaciones y deleciones en el genoma viral Sp1: 5'-(G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)-3' S1 promoter ARNm SL S2 promoter HNF-1: 5-GTTAATCATTACT-3' Terminal Protein HNF-3: 5'-CGTCCGCGGTGA3' ARNm SM Partícula de Dane Spacer S1 S Esférica Tubular S2 C C C C 833 G F A B C D E HNF-3 HNF-1 CAA CT Wild type Sp1 Sp1 Sp1 Sp1 TAC GT S3.1 TAC GT TBP SL S3.2 • 20 1 • 10 10 • 70 89 TAC GT SM S5.1 SS S8.1 • Occult hepatitis B virus infection in chronicliverdisease: full-lengthgenome and analysis of mutantsurface • promoter. Chaudhuri V, Gastroenterology. 2004.

  22. 4.2. Coinfecciones con otros agentes virales HCV Core Se une a la polimerasa e inhibe la encapsidación Se une a la HBx e inhibe la expresión de HBV HBx activa la transcripción • Mechanisms for inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by hepatitis C virus core protein. Chen SY, J Biol Chem. 2003 .

  23. 4.3. Respuesta inmune del hospedador Hospedador Virus Evolución de la infección • Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis B virus infection in HIV co-infected individuals. Martin CM, Cytokine. 2009. • Assessment of CXCL12 (SDF-1alpha) polymorphisms and its serum level in posttransfusion occult HBV-infected patients in Southeastern Iran. Hassanshahi G, Arch. Med. Res 2010.

  24. 4.3. Respuesta inmune del hospedador Viral clearance without destruction of infected. Guidotti LG, Sciece 1999. Células T Vitamin D receptor gene polymorphisms and distinctclinicalphenotypes of hepatitis B carriers in Taiwan. Huang YW,. Genes Immun. 2010 Polimorfismos del receptor regulan la expresión de HBV Respuesta específica no citolítica sFas modula la expresión de HBsAg Receptor de la vitamina D Apoptosis • Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis B virus infection in HIV co-infected individuals. Martin CM, Cytokine. 2009. • Assessment of CXCL12 (SDF-1alpha) polymorphisms and its serum level in posttransfusion occult HBV-infected patients in Southeastern Iran. Hassanshahi G, Arch. Med. Res 2010. Respuesta inmune Reactivación en individuos anti-HBs Reactivation of hepatitis B virus infection after cytotoxic chemotherapy or immunosuppressive therapy. Manzano-Alonso ML, World J. Gastroenterol. 2011. Inmunosupresión

  25. 4.3. Respuesta inmune del hospedador Apoptosis • Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis B virus infection in HIV co-infected individuals. Martin CM, Cytokine. 2009. • Assessment of CXCL12 (SDF-1alpha) polymorphisms and its serum level in posttransfusion occult HBV-infected patients in Southeastern Iran. Hassanshahi G, Arch. Med. Res 2010.

  26. preS2 preS1 S2 prom S S1 prom Polymerase Core BCP Enh I X prom Enh II pC X 4.4. Cambios epigenéticos • La metilación de regiones ricas en CpG es un mecanismo celular para regular la expresión del genes. (no metilado , metilado ). • HBV contiene 3 “islas CpG” (isla 1: 7 sitios, isla 2: 25 sitios, isla 3: 13 sitios). • Se demostró que el genoma de HBV se encuentra metilado en la célula hospedadora. CpG 3 CpG 1 • HBV induce la expresión de DNMTs. CpG 2 Inducción de DNMTs Metilación de CpG Silenciamiento del gen TACGCGGAATACCGCC Expresión de proteínas virales • Methylationregulates hepatitis B viral proteinexpression. Vivekanandan P, J. Infect. Dis. 2009. • Hepatitis B virus replication induces methylation of both host and viral DNA. Vivekanandan P, J. Virol 2010. • DNA Methylation of Hepatitis B Virus (HBV) GenomeAssociatedwiththeDevelopment of Hepatocellular • Carcinoma and Occult HBV Infection. PushpinderKaur, J InfectDis. 2010. • Replicative activity of hepatitis B virus is negatively associated with methylation of covalently • closed circular DNA in advanced hepatitis B virus infection. Kim JW, Intervirology2011. HBV Me Me Hepatocito

  27. 4.4. Cambios epigenéticos • Tejido hepático de • 6 Hepatitis crónica con OBI • 6 HCC sin OBI • 10 HCC con OBI • Se observó una tasa de metilación significativa mayor en pacientes: • con hepatocarcinoma y OBI. • con cirrosis con baja carga viral. • en pacientes antiHBe comparados con HBeAg. Hepatitis crónica con OBI HCC y cirrosis sin OBI HCC con OBI • . Evidencethatmethylation of hepatitis B virus covalentlyclosed circular DNA in livertissues of patientswith • chronic hepatitis B modulates HBV replication. Guo Y, J. Med. Virol. 2009. • DNA methylation of HBV genome associated with the development of hepatocellular carcinoma and occult HBV • infection. Kaur P, J Infect Dis. 2010.

  28. Resumen • 1- Frecuencia de OBI • Depende del grupo en estudio y la prevalencia de HBV en la región. • OBI seropositiva > OBI negativa. (en la mayoría de los casos son anti-HBc +). • En donantes • anti-HBc + 1.00% (0 a 4.6%). • anti-HBc + / anti-HBs + 0.85% (0 a 3.5%) • 2- Riesgo de hepatitis post-transfusional • Es mayor debido al período ventana que a OBI (Carga viral). • La probabilidad es menor en muestras con título antiHBs >100 mIU/ml. • Depende del estado inmunológico del receptor. • 3- Detección • La detección en minipool es significativamente menor que en test individuales. • La viremia en OBI es intermitente, por lo cual el análisis de muestras secuenciales aumenta la probabilidad de detección. • Nested PCR de diferentes regiones aumenta la probabilidad de detección. • 4- Mecanismo: multifactorial • Interacción con otro virus (HCV). • Mutaciones y deleciones en el promotor del gen S. • Mutaciones asociadas al tratamiento ATV que afecten la tasa de replicación. • Metilación de islas CpG.

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