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Chapter 8. Flow-Cytometry. 유세포분석법 (Flow cytometry) 유세포분석법 (flow cytometer : FCM) 이라 하면 , 측정하고자 하는 입자나 세포를 하나 하나씩 흐르는 유액 상태에서 광원으로 쓰여 지는 특정한 Laser 와 부딪쳐서 발생하는 물리적인 현상 ( 빛의 산란현상 , 형광물질의 발광현상 ) 을 이용하여 세포에 관련된 여러 가지 정보를 측정하는 기기이다 . . 유세포검사이론
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Chapter 8. Flow-Cytometry
유세포분석법(Flow cytometry) 유세포분석법(flow cytometer : FCM)이라 하면, 측정하고자 하는 입자나 세포를 하나 하나씩 흐르는 유액 상태에서 광원으로 쓰여 지는 특정한 Laser와 부딪쳐서 발생하는 물리적인 현상(빛의 산란현상, 형광물질의 발광현상)을 이용하여 세포에 관련된 여러 가지 정보를 측정하는 기기이다.
유세포검사이론 • -혈구세포를 흐르는 상태에서 Capillary glass tube로 통과시켜서 자동으로 측정하고자 하는 이론 - Moldvan(1934) 등에 의해서 제안 • - 측정 물질의 흐름이 느린 점과 Large cell이나 Cell cluster에 의해서 자주 관이 막히는 문제점 - Crosland-Taylor(1953)가 흐름체계를 위한 Optical chamber를 개발 • Laminar flow pressure 의 흐름 체계 실용화 -Reynolds의 이론, • 1883 • 물줄기 속을 흐르는 측정하는 세포가 정밀하게 정 중앙에 위치하게 하는 원리인 Hydro-dynamic focusing effect 개발
유세포 분석기가 임상 검사에 이용되고 있는 분야 1.단일 클론 항체를 이용한 림프구의 아형검사 (lymphocyte Immunophenotyping) 2.백혈병(림프종) 아형검사(leukemia or lymphoma immunophenotyping) 3.세포주기의 검사(cell cycle analysis) 4.세포 DNA 배수성 검사(DNA ploidy) 5.아포토시스 세포 검출
구조 및 원리 Fluidic system(유체계) - 세포나 입자를 일정한 감지지역까지 정확하게 운반하고 운반되는 동안 어떤 물리적인 영향도 받지 않도록 보호하는 역할을 한다. Optic system(광학계) - 강한 강도로써 일정한 파장을 만드는 에너지원으로 Laser beam 을 사용 Forward scatter(fsc), Side scatter(ssc) 그리고 세 가지Fluorescent scatter(fl) 의 Parameter 와 각각의 Filter, Detection divices 등을 가지고 있다. Electronic system(전기계) - Digital conversion 이 장착되어Pulse 로부터 생기는 신호를 컴퓨터로 분석하기 위해 모두 수치화하는 역할을 한다.
DNA 분석의 임상적 의의 - 종양세포 집단 중에서 DNA 비배수성의 존재 유무. - DNA 지수(DI)로 표시되는 비배수성 종양의 상대적인 DNA 양. - 세포 집단내에 각 Stemline 의 증식부획. - 정상 DNA 이배수성 집단의 G0/G1 보다 많은 양의 DNA를 갖고 있는 세포집단의 백분률. - 종양의 예후인자로 DNA 판독시 데이터의 일관성과 신뢰도를 표시하는 지표를 제공.
유세포 분석의 단점과 장점 단점 1. 부유액 상태로 만들어야만 검색을 할 수가 있어서 조직의 구조에 대한 정보를 얻을 수 없다. 2. 검체의 부피가 적거나 섬유화 또는 괴사가 심할 경우에도 세포 획득에 지장을 초래 할 수 있다. 3.적은 부위에만 종양이 국한된 경우에는 종양 세포의 특징이 간과될 우려가 있다.
장점 1, 기존의 면역 형광현미경 검색이나 면역효소 염색법에 비하여 민감도(sensitivity)와 정확도(specificity) 월등 2, 질병의 기능적 상태를 측정하고 질병의 추이를 관찰하는 데에는 유용한 검색법이라 할 수 있다. 3, 염색 과정이 매우 간단하여 검사가 신속하고 많은 항원 등에 대한 검사를 동시에 실시 할 수 있다. 4, 결과가 숫자로 표현되어 객관성 있게 재현될 수 있다는 점이다.
Flow Cytometry (FCM) • Principle Computer Arithmetic Processor laser beam Numerical data Single cell suspension
1.Image analyzer의 원리 Image analyzer는 Microscope와 Video camera.등의 입력매체를 통하여 가시화된 영상을 컴퓨터가 처리할 수 있는 Digital 값으로 변환, 그 값을 화상처리 기법을 통한 계산과정을 거쳐서 원하는 새로운 화상을 도출하게 하고, 관찰하고자 하는 목적물의 면적, 장반경, 둘레, 길이, 농도, 각도 등을 측정하여 수치적으로 결과를 뽑아내고, 그 결과를 통계적으로 처리하여 측정화상의 특성을 분석하는 장치이다.
시스템 구성 초기화(Calibraion) 단계. 화상의 입력과 저장. 화상의 최적화 및 복원화(Enhance). 2치화(Segmentation). 2치 화상의 처리(Binary). 측정(Measurement). Data output.
초기화(Calibration)단계 -Clear all : 모든 Graphic overlay와 Image를 지워서 깨끗이 한다. -Reset parameter : 기존의 Parameter를 지운다. -Look up "Grey" : 흑백 화상처리를 위한 Look up table을 부른다. -Set image size : Monitor로 띄울 화상의 전체 크기를 결정한다. -Peripherals : Microscopy인지 Scanning stage video camera 인지를결정한다. -Scaling define setup : 현미경 각각의 배율과 Image analyzer의 배율을 맞추기 위하여 Micrometer를 이용한 Scaling 작업을 한다.
화상 입력 단계 -TV online, input, offline. 화상 향상을 위한 처리 기능 단계(Enhance) -프레임 및 윈도우 기능 : Zoom, Shift, Rotate, Transform. -픽셀 기능 : Contrast, Normalization, Histogram, Liberalization.Shading. -매트릭스 기능 : Highpass, Lowpass, Sobal, Median, Sigma.
2치화(Segmentation) 2치화는 측정되어야 하는 Object와 Backgroud를 만드는 화상 정보의 분리 단계이다. 2치화의 결과는 2치 화상(Binary image)이고 여기서 측정 입자는 White color(농도값 255)로 배경은 Black color(농도값 0)로 표시된다. Threshold에 의한 Segmentation, Automatic, Dynamic discrimination등이 있으며, 너무 낮거나 너무 높은 Contrst, 선명하지 않은 화상, 잡음, 인공적인 입자들, 분해능 문제, 화상 구조의 복잡성등은 측정의 정확성에 영향을 미치는 원인이 된다. 만일, 입자의 2치화가 첫 번째 시도에서 실패하는 경우에 정확도를 증가시키기 위해서는, 다음과 같은 올바른 화상 전처리와 후처리 기능을 선택하는 것이 관건이 된다. -알맞은 대비(High contrast). -균일한 배경. -입자의 선명한 윤곽. -완전한 구조. -입자의 작은 크기 변화. -최상의 신호대 잡음비. -기하학적인 왜곡이 없을 것. -서로 붙어 있는 입자가 없을 것.
2치 화상의 처리(Binary) 불필요한 입자의 포함이나, 부분적인 화상의 측정을 할 때, 추후의 처리가 필요하다. -Binary image clearing : 불필요한 입자를 제거하는 Scarp기능들. -Morphology operations : Erosion, Dilation. -Boolean operations : And, Or, Xor등 두 화상의 산술 연산기능. -Binary masking/marking : 농도화상과 2치화상 또는, 2치화상 사이의 작용. -Thinning : 얇은 망사 모양의 측정 등에 사용.
측정(Measurement) 측정입자는 대표적으로 Optical density(OD)를 갖는 Product로 표현된다. Optical density는 현미경 화상에서 Object에 투과된 빛의 휘도(Object grey level)를 염색된 Slide위의 조사된 빛의 휘도 즉, Object 주위의 배경휘도(Background grey level)로 나누는 Transmittance(T)에서, log 함수의 분포를 따르는 Object의 흡광도를 비교하기 위해서 T의 역수를 상용대수로 표시한 것이다. 또한, Object는 여러개로 구성된 화소(면적)를 합한 값인 Integrated optical density(IOD)로도 나타내는데, 이는 Object내 흡광물질의 총량과 비례적이다. 따라서, 현미경 화상내 Object의 평균 OD와 IOD는 다음과 같으며 이것은, 2치화상에서 정의한 Object를 보정된 Grey image로부터 화소의 휘도값을 추출하여 OD를 산출한다. 화상이 측정되기 전에 모든 입자들은 해당 번호가 할당되어 서로 다른 Color로 개별 표시가 되는 확인(Identification)을 거친후, 분석목적에 부합하는 Parameter의 설정(Select)을 한다. -Object specific parameters : 각 개개의 확인된 입자에 하나의 데이터 값을 주는데, 면적(Area), 직경(Diameter),둘레길이(Perimeter)등이 있다. -Field specific parameters : 한 필드당 하나의 값.(Fieldcount, Percentage, Total area) -Densitometric parameters : 농도 값을 계산.(Optical density, IOD.등) -User defined parameters : User가 새로운 Parameter를 정의.또한, 측정의 형태는 다음과 같다. -완전자동 측정 : User가 측정 과정을 보지 않아도 자동적으로 결과를 얻을 수 있다. -보정 가미한 자동측정 : 원하는 부분을 보정하고 계속 실행한다.(두 입자가 겹친 경우) -Interactive 측정(Manual) : 화상구조가 너무 복잡하여 수동적인 측정이 불가피 할 때.
Data output 결과는 Data list, Histogram, Scatter diagram, Cross tabulation, Probability plot, Report 3D profile 등으로 통계 처리되어 출력하고, Copy와 Edit를 하여 보관이 가능하다.
