Chapter 4. Manipulation of purified DNA • Nuclease ; 핵산 분자를 절단하거나 짧게 하는 효소

Chapter 4. Manipulation of purified DNA • Nuclease ; 핵산 분자를 절단하거나 짧게 하는 효소 • Ligase ; 핵산 분자들을 연결해 주는 효소 • Polymerase ; - 핵산 분자의 복사체를 만드는 효소 - DNA를 절단 역할도 함 • Modifying enzyme ; 화학기능기를 첨가 또는 제거하는 효소 • Topoisomerase ; cccDNA에 supercoiled form으로 만들거나 제거하는 효소 • Ribonuclease ; RNA를 제거하는 효소

• Nuclease ; Phosphodiester bond를 파괴 함으로써 DNA 분자를 절단 . Exonuclease ; - DNA 분자의 말단에서 Nucleotide를 하나씩 제거 . Endonuclease ; - DNA 분자의 내부에서 Nucleotide를 하나씩 제거

• Bal31 exonuclease - Alteromonas espejiana로부터 정제 - 이중가닥 DNA 말단으로부터 양가닥을 절단 • Exonuclease III - E.coli - 이중가닥 DNA의 3’말단 한가닥만 절단

• S1 endonuclease - Aspergillus oryzae - 이중가닥 DNA 분자의 한가닥 또는 한가닥 DNA만 절단 • Deoxyribonuclease I (Dnase I) - 암소 췌장 - 한가닥 DNA 분자 또는 이중가닥 DNA 분자 모두를 절단 • Restriction endonuclease - 어떤 특별한 인식부위 (제한된 숫자)의 이중가닥 DNA 분자를 절단

• Ligase ; - DNA 복제 동안에 이중가닥 DNA 중 한 가닥의 phosphodiester bond 파손을 복구 - 이중가닥 DNA 단편을 연결

•중합효소 (Polymerase) – DNA 또는 RNA 가닥으로부터 새로운 DNA 가닥을 합성하는 효소 –주형 가닥에 중합할려는 곳이 이중가닥 (primer)으로 존재한 경우 •DNA polymerase I – E.coli –이미 존재하는 DNA가닥을 절단하면서 새로운 가닥을 형성 – DNA polymerization – DNA degradation •Klennow fragment (modified enzyme) – DNA polymerization •Taq DNA polymerase (PCR) – Thermus aquaticus –열 저항성 •Reverse transcriptase – RNA를 주형가닥, virus – Complementary DNA (cDNA)

• DNA modifying enzyme • Alkaline phosphatase ‑ E.coli, 송아지 장 조직 ‑ DNA 분자 5’말단의 인산기를 제거 • Polynucleotide kinase ‑ T4 phage에 감염된 E.coli ‑ Alkaline phosphatase의 반대 역할 ‑ Free 5’말단에 인산기를 첨가 • Terminal deoxynucleotidyl- transferase ‑ 송아지 가슴샘 조직 ‑ DNA 분자의 3’말단에 하나 또는 그 이상의 deoxynucleotide를 첨가

• Enzyme for cutting DNA- restriction endonucleases ‑ 1978년 ‑ W.Arber, H.Smith, D.Nathans

•제한효소의 발견과 기능 ‑1950년 초 ‑ Host-controlled restriction ; 박테리아가 phage감염에 면역성이 있음 ‑ Phage DNA를 절단하는 제한효소 ‑ 박테리아 DNA는 메틸기가 존재하여 제한효소에 의해 절단되지 않음 • 1200개 이상의 효소 ‑ Type I ‑ Type II ; 유전공학에 널리 이용 Mg2+ ‑ Type III

제한효소 ; 각 효소가 DNA 분자를 특별한 염기배열을 인식하여 절단

• Blunt ends and sticky ends ‑제한효소에 의해 생성된 절단 부위

•제한효소의 인식 염기배열 수 • ‑ GC 함유 = 50% • ‑ 4개의 다른 뉴클레오티드가 • 같은 비율로 존재 • • Tetranucleotide • ‑ Sau3A (GATC) • ‑ 44=256 / 1번 • • Hexanucleotide • ‑ BamHI (GGATCC) • ‑ 46=4096 / 1번 • 13 sites • ‑ 49 kb / 4096 bp =12 sites • ‑ GC 함유량이 50% 이하

•효소 1 unit (u) ; ‑ 1 시간당 1 ug DNA를 절단하는데 필요한 양 • pH=7.4 • Temperature • Mg2+ 농도 • Ionic strength (NaCl) • DTT (환원제) ; ‑ 효소 안정화 및 비활성 방지 •효소의 비활성화 ; ‑ 온도 (70 oC) ‑ Phenol ‑ EDTA ; Mg2+ 과 결합

• DNA ; 음전하 ‑ DNA 이동속도 ; 구조와 전하 : 질량비 • Agarose 또는 Polyacrylamide • 0.5% Agarose ‑ 1 ~ 30 kb DNA 분자 ‑ 10 ~12 kb DNA 크기 분리가 적당 • 40% polyacrylamide ‑ 1 ~ 300 bp

•자동방사선 사진법 (Autoradiography) ‑ DNA 2ng 이상 ‑ EtBr ; DNA 25ng 이상

•방사성 표지 방법 1. Nick translation ‑ DNA polymerase I ‑ dNTP ‑ DNA를 절단 2. End-filling ‑ Sticky end DNA fragment ‑ Klenow fragment

D = a-b(logM) D; 이동거리 M; 분자량 a, b; 상수

• Restriction mapping

• DNA ligase 결합 반응 ‑T4 phage에 감염된 E.coli에서 정제 ‑ Phosphodiester bond ‑ 단일 가닥 불연속을 복원 ‑ 다른 두 개의 DNA 분자를 결합 ‑ Sticky end가 blunt end 보다 ligation 효율이 높다 ; 수소결합

• Blunt 말단에 sticky 말단 으로 만드는 방법 ‑ Linker

• Blunt 말단에 sticky 말단 으로 만드는 방법 ‑ Adaptor

• DNA 5’말단 ; phosphate group (5’-P) • DNA 3’말단 ; hydroxyl group (3’-OH) • Ligation ; ‑ 5’-P 과 3’-OH 사이에서 결합

• Adaptor ; ‑ 5’– OH 으로 변형 ‑ Adaptor끼리 결합 방지 ‑ Polynucleotide kinase에 의해 정상적인 5’– P 으로 변형

• Blunt 말단에 sticky 말단 으로 만드는 방법 ‑ Homopolymer tailing • Terminal deoxynucleotidyl transferase ‑ Vector ; polydeoxycytosine ‑ DNA ; polydeoxyguanosine ‑ Klenow polymerase ‑ Ligase

Chapter 4. Manipulation of purified DNA • Nuclease ; 핵산 분자를 절단하거나 짧게 하는 효소