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L’apoptose

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L’apoptose

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Presentation Transcript

  1. L’apoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly

  2. I. Définitions et processus

  3. La mort cellulaire • 2 types de mort cellulaire : • apoptose • Nécrose • Apoptose =Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD) • PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques

  4. Rôles de la mort cellulaire • Elimination des « surplus » de cellules saines : • Embryologie (cavités, morphogénèse, structures vestigiales, cellules « en trop ») • homéostasie = constance de la masse cellulaire • processus physiologiques (cellules mammaires, endomètre, cellules épithéliales…) • Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…) • Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)

  5. Apoptose et Nécrose Se différencient par : • Leurs mécanismes et modalités de déclenchement • la morphologie des cellules • les conséquences tissulaires • leurs significations biologiques

  6. Atrophie Intégrité organelles et membrane Condensation du noyau Bourgeonnement de la membrane Fragmentation (« corps apoptotiques ») Phagocytose / C voisines Pas d ’inflammation Turgescence Lyse des organelles et des membranes Pas de condensation Rupture des membranes Libération du contenu cellulaire Lyse de la chromatine Phagocytose tardive Inflammation Apoptose vs Nécrose

  7. Apoptose Nécrose

  8. Photo Molecular Probes

  9. 1. Nécrose : membrane et organelles Altérées, noyau + conservé x 10 000 (TEM) 2. Apoptose (A) réarrangement de la chromatine (vs normal N), membrane ++ x 8000 (TEM) 3. Nécrose (SEM) x 5000 4. Apoptose (SEM) bourgeonnements x 5000 5. Cellule normale : pores nucléaires x 30 000 (FF) 6. Apoptose : confluence des pores nucléaires x 35 000 (FF)

  10. Remarques • Etats intermédiaires : • facteurs déclenchants communs • importance des ressources énergétiques (ATP) • succession apoptose puis nécrose • Etat apoptotique « fugitif » inaperçu (phagocytose très rapide)

  11. Un schéma simple :Caenorhabditis elegans 3 étapes : 1) apparition de signaux (externes ou internes) 2) activation de protéases cellulaires 3) formation des « corps apoptotiques » et phagocytose Signal Inactivation Inactivation EGL-1 ----> CED-9 ----> CED-4 ----> CED-3 ----> Apoptose + CED-3 activé Membrane C Etape intra cellulaire

  12. Schéma général de l ’apoptose T cell CD8 TNF Fas Ca ++ Conditions physico-chimiques NK Perforin Granzyme B Bcl2-pro Récepteurs de mort Bcl2-anti Caspase 8 Mitochondrie Dégranulation P53 AIF Cytochrome C Cyclines Caspase 9 Caspases effectrices Caspase 3 (Caspases 6 et 7) ADN, noyau

  13. Les signaux déclencheurs • Déclencheurs extra-cellulaires : • Souvent communications entre cellules • insuffisance de signaux suppresseurs de « PCD » • augmentation de signaux inducteurs • Déclencheurs intra-cellulaires • réponse à des stimuli ou à des perturbations métaboliques

  14. ! Combinaison des 2 types de signaux Les récepteurs ont des rôles multiples (ex prolifération, différenciation, survie) Rôle différent du récepteur selon type cellulaire ex. récepteurs des stéroïdes Différents mécanismes d ’induction souvent associés

  15. Signaux extra-cellulaires Insuffisance de signaux suppresseurs • Cultures cellulaires : concentration, sérum, diverses molécules solubles ou liées à la membrane (variations selon le type cellulaire) • Liaison cellules cibles • ex. neurones = adaptation au nombre de cibles Augmentation de signaux inducteurs Ex = perte queue des têtards = rôle de l ’hormone thyroïdienne

  16. Signaux intra-cellulaires = lésions de la cellule produites par : drogues, toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus… qui ne sont pas des « inducteurs » spécifiques = « seuil de lésions » déclenchement de la PCD = activation des caspases,de protéines proapoptotiques (voie p53 dépendante)ou protéines kinases

  17. Induction in vitro Fas ou Ac anti Fas (CD95) TNF ou ligands du TCR Pas de sérum ou de facteur de croissance UV H2O2 Glucocorticoides Ionophore calcium Camptothecine Contact lymphocytes T cytotoxiques ou NK activés + concentration cellulaire, équilibre de populations Temps nécessaire = 2 à 6 h

  18. Voie Fas-L (CD 95) Fas Fas-Ligand Membrane cellulaire Fas (trimérisation) FADD Fas Associated protein with Death Domain Pro Cas 8 Cas 8 Pro Cas 3 Autres Cas

  19. Apoptosome m Cytochrome C dATP Pro Cas 9 Cyt C (AIF) Apaf-1 Caspase 9 Apaf-1 Cyt C Pro Cas 9 AIF = Apoptosis Inducing Factor Apaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1

  20. Les caspases = C aspases Cystéines protéases, résidus acide aspartique 14 caspases et pro-caspases 3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammation II= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptose III = 6, 8, 9 ---> «  Activation des caspases « entre elles » = « cascade » irréversible

  21. Rôle très important de la caspase 3 exécuteur-clé (qq soit le stimulus) Régulation de la cascade par des protéines activatricesinhibitrices APAF1 Bcl2 FADD RIP FLASH Bcl2 Activation en présence de : ATP + cytochrome C (rôle de la mitochondrie)

  22. La famille des Bcl2 Action sur les membranes mitochondriales = libération ou non du cytochrome C (proApo ou antiApo) Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid… Mbrane mitochondrie (Bad Bid = cytosol) Bcl2* Bclxl* Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1 (*= inhibe Cas9) + formation homodimères ou hétérodimères = régulation

  23. II. Méthodes d’analyse de l’apoptose

  24. * Membranes cellulaires = Translocation des phosphatidylsérines (Annexin V) * Mitochondries = Potentiel de membranes (sondes fluorescentes) = Libération du cytochrome C (Ac ELISA) = Libération de AIF « Apoptosis inducing factor » (Ac ELISA) * Noyau = Clivage de l ’ADN - Ac anti-histones - fragments (180 pb) : gel d ’agarose (« DNA ladder ») - TUNEL ou TdT : extrêmités 3’OH - nucléosomes (ELISA) = Libération des « Nuclear Matrix Proteins » (NMPs) Ac

  25. * Dosages de molécules = Récepteurs des signaux Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF = Caspases Ac ou activités enzymatiques (substrats spécifiques) ==> fluorescence) = Protéines régulatrices (pro ou anti) Ac = Glutathion = calcium * Gènes impliqués

  26. Cytométrie en flux et étude de l’apoptose

  27. Principe de la cytométrie en flux • Cellule par cellule, quantification de la fluorescence • Plusieurs paramètres simultanément pour chaque cellule(jusqu'à 11 paramètres dont 8 fluorescences) • Sélection de populations (analyse et tri) • Analyse de cellules vivantes, grand nombre en peu de temps

  28. 2 types de signaux • Signaux de diffusion de lumière diffusion frontale de la lumière = FSC = Forward Scatter diffusion latérale de la lumière = SSC = Side Scatter • Signaux de fluorescencecouleur d’émission de fluorescence : violet, bleu, vert, jaune, orange, rouge

  29. Spectres d’excitation et d’émission de la fluorescéine Spectre d’excitation Spectre d’émission Invitrogen Molecular Probes

  30. Analyse monoparamétrique : exemple la fluorescence Témoin : autofluorescence des cellules Après marquage spécifique Nombre de cellules parclasse d’intensité (« canal ») Intensité de fluorescence verte => échelle exprimée en unités arbitraires ou canaux Population pure => une gausssienne

  31. Analyse biparamétrique : exemple de deux fluorescences • double marquage : amélioration de la discrimination entre les populations • cellules positionnées en fonction coordonnées sur les 2 axes Population doublement marquée Populations simplement marquées Population non marquée Intensité de fluorescence rouge Intensité de fluorescence verte

  32. Analyse multiparamétrique Sélection des cellules sur les paramètres de diffusion de lumière

  33. Analyse multiparamétrique Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T Cellules mortes Cellules en apoptose Cellules vivantes région 1 Nombre de cellules par classed’intensité (« canal ») région 2 Cellules mortes Cellules en apoptose Cellules vivantes Intensité de fluorescence orange

  34. Le tri et ses options • Pourquoi trier ? • Vérification des analyses • Autres analyses (cytométrie ou autre méthodologie) • Mise en culture (tri « stérile ») • Comment trier ? • Une à quatre populations différentes • Vitesse de tri maximum 50000 Cellules/s • Support : lames, tubes, plaques à microtitration • Milieu : « coussin », PBS, RPMI… (+ SVF) • La pureté, la viabilité, la stérilité

  35. Principe du tri par cytométrie A Buse Rayon laser Analyse F Drop delay « Break off » Gouttelettes détachées Plaques de déflection - 2500 V + 2500 V

  36. Exemple de tri par cytométrie Analyse avant tri Réanalyse après tri 99.6 % de pureté Drouet-Viard (2001)

  37. Etapes principales de l’apoptose analysées en cytométrie Récepteurs de mort calcium Pro Bcl2AntiBcl2 Potentiel de membrane membrane mitochondrie récepteursaltérations identification activité caspase Fragmentation « Nuclear Matrix Protein (NMP) noyau

  38. Mise en évidence des récepteurs de mort Fixation ligand spécifique => formation complexe multiprotéique Anticorps dirigés contre les récepteurs de mort fonctionnels : • anti Fas (anti CD95) • anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5…) • anti DCR2, DCR3… => réaction immunofluorescence directe ou indirecte Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and molecular medicine 32, 246-254.

  39. Mise en évidence des protéines agissant au niveau mitochondrial • Anticorps dirigés contre • les protéines proapoptotiques: Bax • les protéines antiapoptotiques : Bcl2 • la forme tronquée de Bid (obtenu après action caspase 8) Perianayagam et al (2003). European Journal of Clinical Investigation 33, 905-911.

  40. Variation du calcium intracellulaire Etape précoce de l’apoptose => augmentation du calcium intra-cellulaire • mesure du fluxde Ca++=> Fluo3 • mesure quantitative du Ca++ : • - Fura-2 modification spectre d’excitation • - Indo-1 modification spectre d’émission fluorochrome libre : émission 475nm (B)fluorochrome lié : émission 400nm (A)mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre Spectre d ’émission de l ’indo-1

  41. Variation de calcium intracellulaire utilisation du fluo-3 Cellules témoins Cellules traitéesVérapamil Induction apoptose par la roténone sur des cellules neuronales WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11, 376(2) : 127-32. Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr 21;11(15):2255-9.

  42. Modifications membranaires • Modification graduelle de la perméabilité membranaire pénétration plus facile : Hoechst 33342 ou Yo-Pro1 • Perte de l’assymétrie membranaire : externalisationdes phospholipidesAnnexineV reconnaît les phosphatidylsérines • Etude du désordre lipidique membranaire externalisation des phosphatidylsérines => modification organisation membranaire => augmentation fixation merocyanine 540 discrimination cellules mortes-cellules vivantes

  43. Externalisation des phosphatidylsérines Cellules mortes Intensité de fluorescence rouge (7AAD) Cellules vivantes Cellules en apoptose Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC) Résultats A-M Chaussé (1996)

  44. Externalisation des phosphatidylsérines Lignée de cellules T humaines, coloration annexineV Alexa 488 et Iodure de propidium Photo : Molecular Probes Cellule en nécrose Cellule en apoptose

  45. Modifications dans la mitochondrie Action protéines proapoptotiques (Bax…) Ouverture des pores de transition • modification équilibre ionique : dépolarisation de la membrane mitochondriale • libération cytoplasmique du cytochrome c • libération cytoplasmique des protéines SMAC/Diablo • libération cytoplasmique des AIF

  46. Mise en évidence de la dépolarisation de la membrane fluorochromes cationiques et lipophiles incorporation potentielle dépendante => variation du potentiel mitochondrial exemple : DiOC6, Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1… • mitochondries fonctionnelles = multimères => fluorescence rouge • mitochondries non fonctionnelles = monomères => fluorescence verte JC-1 Cellules normales Cellules en apoptose Intensité de fluorescencerouge Cellules mortes D’après Salvioli S. et al. (2000) Cytometry 40:189_197 Intensité de fluorescence verte

  47. Incorporation d ’un fluorochrome cationique : le JC-1 Coloration d ’une lignée de fibroblastes au JC-1, différents temps de stimulation de l ’apoptose Photo : Ildo Nicoletti, Perugia University Medical School.

  48. Mise en évidence de la libération cytoplasmique du Cytochrome C • Anticorps dirigés contre le Cytochrome C + Act D -Act D Coloration d’une lignée de cellules T humaines Photo et Histogramme : Merck Novagen

  49. Activité enzymatique des caspases Procaspases précurseurs inactifs Caspases actives ===> • forme active : anticorps • site actif de l’enzyme : Peptide spécifique (FLICA) • quantification de l’activité enzymatique Caspase active Substrat non fluorescent produit fluorescent

  50. Exemple de mesure de l’activité enzymatique • monoparamétrique activité caspase • biparamétrique : activité caspase et ploïdie Quantité d ’ADN (Iodurede Propidium) Cellules en apoptose Activité caspase (FITC) F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001)