1 / 32

Polymerase Chain Reaction

Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell Annica.Nordvall@ki.se. Polymerase Chain Reaction. Polymerase Chain Reaction. Kary Mullis f.1944 Presenterade PCR i Science 1985 Nobelpriset i kemi 1993. Vad är PCR?. Kopieringsmaskin för DNA?

imala
Download Presentation

Polymerase Chain Reaction

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell Annica.Nordvall@ki.se Polymerase Chain Reaction

  2. Polymerase Chain Reaction • Kary Mullis f.1944 • Presenterade PCR i Science 1985 • Nobelpriset i kemi 1993

  3. Vad är PCR? • Kopieringsmaskin för DNA? • Kan påvisa att ett prov innehåller en viss gen

  4. Varför var PCR revolutionerande? • Kan kopiera EN SPECIFIK DNA-sekvens bland tusen andra gener • Snabb (jämfört med genkloning) • Känslig kan detektera DNA från enstaka celler • Robust kan detektera DNA från fossila prover

  5. Repetition: syntes av ny sträng • Templat: ssDNA som fungerar som mall för den nya strängen • Primer: för att starta DNA-syntesen • Nukleotider(dNTP´s): utgör ”byggstenar” i DNA • DNA-polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5´P och 3´OH

  6. Vad behöver man i röret? • Templat (prov med DNA) • Forward primer (startsekvens) • Reverse primer (startsekvens) • dNTP´s (byggstenar) • Taq DNA polymeras • Buffert, salter Primers Nukleotider DNA Salt Polymeras Buffer

  7. Vad händer i röret? Tre steg: • Denaturering 95oC • Annealing av primers 55-70oC • Syntes av ny sträng 72oC Detta upprepas 20-30 ggr www.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF

  8. Taq Taq Två primers behövs DNA templat 3’ 5’ Riktning på extension 5’ 3’ reverse Primer 5’ 5’ forward Primer Riktning på extension 5’ 3’ • Forward primer • Hybridiserar uppströms om genen • Reverse primer • Hybridiserar nedströms om genen • Syntes ”in mot genen”

  9. Taq DNA polymeras • Värmestabilt • Optimalt vid 72 °C • Adderar nukleotider komplementära till templatsträngen • Dubbelsträngad DNA bildas • Syntes från 5´till 3´ http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg http://www.cinnagen.com/images/smar%20taq%20dna%20polymerase.jpg

  10. Amplifiering av målsekvens! http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

  11. Resultat • Området mellan primrarna; målområdet, ”target” amplifieras exponentiellt • x2 x2 x2 x2 osv…. • Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 109 kopior av målområdet

  12. Detektion av PCR-produkt • Gelelektrofores • Separation av DNA • Färgning av DNA • Alt: Realtids- PCR

  13. Vad betyder ett band i gelen • Det har bildats DNA-molekyler vid PCR-reaktionen. • Primrarna måste ha bundit till DNA i provet • Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna • Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-DNA fanns i provet

  14. Tillämpningar • Diagnos av bakt/virusinfektion • Rättskemiska analyser • Diagnos av ärftliga sjukdomar • Sekvensering • Kloning • Kvantifiering av genuttryck (RT-PCR) • Med mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

  15. Begränsningar? • Man måste känna till sekvensen på båda sidor om den DNA-sekvens man vill amplifiera • Kan ej amplifiera långa gener

  16. Problem vid PCR • Ospecifika produkter • Kontamination • Inhibition

  17. Optimering av PCR-reaktion • Val av primerpar • Annealingtemperaturen (beror på primers) • Mg2+-koncentration

  18. Ospecifika produkter • Vad har hänt? • Hur kan det bildas flera produkter?

  19. Primerlängd • 8-mer ger statistiskt 46000 möjliga sekvenser att hybridisera till i humana genomet • 17-mer har 1 chans på 17179869184 bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens Fig. 11.5 Brown Gene Cloning

  20. Kontamination Positivt prov • ”Carry-over” kontamination från ett amplifierat positivt prov till ett nytt prov • En aerosoldroppe kan innehålla 500 kopior av målområdet • Efter amplifiering har man fått miljoner kopior; falskt positivt prov • För att upptäcka ev. kontaminering körs en negativ kontroll (utan templat DNA) Negativt prov kontamination

  21. Separata rum • DNA extraktion • prePCR rum (renrum) • PCR rum

  22. Inhibering • Rester från prov eller DNA-extraktion kan inhibera PCR-reaktionen • Risk för falskt negativa prov • Intern kontroll tillsätts, om den inte amplifieras tyder det på inhibering PCR-film

  23. Brister med traditionell PCR • Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering • Långsam, svår att automatisera • Mäter vid slutpunkt; osäker kvantif. • Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner

  24. Realtids-PCR • Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkter varje cykel • Mätning av PCR-produkter under den exponentiella fasen ger ett säkrare värde än mätning efter att alla cykler körts (end point)

  25. End point/Real time • Konventionell PCR • Analyserar produkten vid slutpunkt • Realtidsmätning • Bildad produkt detekteras med fluorimeter • Mäter PCR-produkt vid varje cykel http://www.lightcycler-online.com/ lc_principles/lc_principles_ind.htm

  26. CT = Cykel vid tröskelvärde • Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden • CT=den cykel när signalen passerar ”tröskeln” • Ju mer mål-DNA desto lägre CT (BioRad)

  27. Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering 96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar VARFÖR? Tröskelvärde (CT) varierar inte • (Fig från BioRad)

  28. Realtids-PCR iCycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche, kapillärer ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor

  29. Realtids-PCR Fördelar • Lättare att undvika kontamination • Behöver ej öppna röret för detektion • Säkrare kvantifiering av mål-DNA

  30. Realtids-PCR Tillämpningar • Kvantitativ analys (Q-PCR) • Ex. jmf mRNA i olika celler • Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika PCR-produkter) • Ex. detektera flera virustyper i samma prov • Detektion av mutationer (med FRETprober och smältkurvsanalys)

  31. Spel • http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/index.html

  32. Länkar Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk, http://www.biointeractive.org/vlabs/index.html Välj The Bacterial Identification Lab, Öppna dörren till labbet och kör en PCR!

More Related