planar chromatography l.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Planar Chromatography PowerPoint Presentation
Download Presentation
Planar Chromatography

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 27

Planar Chromatography - PowerPoint PPT Presentation


  • 551 Views
  • Uploaded on

Planar Chromatography. อ.พุทธรักษา วรานุศุภากุล ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. Planar Chromatography. เป็นเทคนิคทางโครมาโทกราฟีที่มีรูปแบบของการบรรจุหรือวางตัวของเฟสคงที่แบบแผ่นเรียบ (Planar Chromatography) เฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ใน Planar Chromatography

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Planar Chromatography' - hea


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
planar chromatography

Planar Chromatography

อ.พุทธรักษา วรานุศุภากุล

ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

planar chromatography2
Planar Chromatography
  • เป็นเทคนิคทางโครมาโทกราฟีที่มีรูปแบบของการบรรจุหรือวางตัวของเฟสคงที่แบบแผ่นเรียบ (Planar Chromatography)
  • เฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ใน Planar Chromatography
    • เฟสคงที่: ติดอยู่บนแผ่นเรียบหรือในรูพรุนของกระดาษ
    • เฟสเคลื่อนที่: เคลื่อนผ่านเฟสคงที่ด้วยแรงแคพิลลารี (capillary action) หรือแรงโน้มถ่วง (gravity)
  • เทคนิคทาง Planar Chromatography
    • Paper Chromatography (PC) – ง่ายที่สุดในโครมาโทกราฟี
    • Thin-Layer Chromatography (TLC)

เฟสคงที่

flat plate

why planar chromatography
Why Planar Chromatography?
  • เป็นเทคนิคที่ง่าย
  • เครื่องมือและอุปกรณ์ที่ใช้ไม่ซับซ้อน
  • ค่าใช้จ่ายในการวิเคราะห์ไม่สูง
  • เวลาที่ใช้ในการแยกไม่นานมาก
  • มีความไวในการวิเคราะห์ (sensitivity) พอสมควร
  • สามารถทำวิเคราะห์สารตัวอย่างได้หลายๆ ตัวในเวลาเดียวกัน
planar chromatography4
เทคนิคของ Planar Chromatography
  • Paper Chromatography (PC)
    • ใช้กระดาษกรองซึ่งเป็นพวกเซลลูโลสเป็นเฟสคงที่
    • ขนาดรูพรุนของกระดาษกรองเป็นตัวกำหนดการเคลื่อนที่ของตัวทำละลาย (เฟสเคลื่อนที่)
      • กระดาษที่มีรูพรุนน้อยหรือละเอียดมากจะทำให้การเคลื่อนที่ของตัวทำละลายช้า และเกิดการแยกที่ดี
      • กระดาษที่หนาจะทำให้มีความจุของสารตัวอย่างเพิ่มขึ้น – เหมาะกับงานด้าน preparative separation
  • Thin Layer Chromatography (TLC)
    • ทำการยึดเฟสคงที่บนแผ่นเรียบ เช่น แผ่นกระจก อะลูมิเนียม หรือพลาสติก
    • องค์ประกอบของแผ่น TLC
      • Support – แผ่นเรียบที่ใช้ยึดเฟสคงที่
      • เฟสคงที่ (Sorbent)
      • ตัวยึด (Binder) – เพิ่มความแข็งแรงของการยึดติดเฟสคงที่กับแผ่นเรียบ (มีหรือไม่มีก็ได้)
      • Fluorescent indicator (มีหรือไม่มีก็ได้)
planar chromatography5
การแยกโดย Planar Chromatography
  • อาศัยความแตกต่างในการเคลื่อนที่ของสารผ่านเฟสคงที่บนแผ่นเรียบหรือรูพรุนของแผ่นกระดาษ
  • กลไกของการแยกใน Planar Chromatography
    • การดูดซับ (Adsorption): กลไกที่ใช้มากที่สุด
    • การแพร่ (Partition)
    • การแลกเปลี่ยนไอออน (Ion-exchange)
  • อัตราการเคลื่อนที่ของสารบอกด้วยค่า retardation factor (Rf)
retardation factor r f
Retardation Factor, Rf

Solvent front

Mid-point of substance zone

จุดเริ่มต้น

  • บอกอัตราการเคลื่อนที่ของสารบนแผ่นเรียบ ซึ่งเท่ากับอัตราการเคลื่อนที่สัมพัทธ์ของสาร
  • ค่า Rf คำนวณจากอัตราส่วนของระยะทางที่สารเคลื่อนที่กับระยะทางที่เฟสเคลื่อนที่เคลื่อนไป ดังนั้น ค่า Rfจะมีค่าน้อยกว่าหรือเท่ากับ 1 เท่านั้น
slide7
ธรรมชาติของตัวดูดซับ (sorbents)

ธรรมชาติทางเคมี

ขนาดของอนุภาคและพื้นที่ผิว

ตัวยึด (binder)

ธรรมชาติของเฟสเคลื่อนที่

ความบริสุทธิ์

ความถูกต้องของส่วนผสม

ความชื้น (humidity)

การระเหย

การยึดตัวดูดซับกับแผ่นเรียบ

Activity ของตัวดูดซับ

ความหนาของตัวดูดซับ

ความสม่ำเสมอของการยึด

อุณหภูมิ

ปริมาณของสารตัวอย่างที่ใช้

สมดุลของความดันไอของเฟสเคลื่อนที่บนแผ่นเรียบกับบรรยากาศในถัง (chamber)

ปัจจัยที่ส่งผลต่อค่า Rf
thin layer chromatography tlc
Thin Layer Chromatography (TLC)

องค์ประกอบของแผ่น TLC

  • Support: แผ่นเรียบที่ใช้ยึดเฟสคงที่
    • ควรมีความแข็งแรง ไม่ว่องไวและทนต่อตัวทำละลายที่ใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ และมีความสม่ำเสมอของพื้นผิว
    • วัสดุที่ใช้ เช่น แผ่นกระจก อะลูมิเนียม หรือพลาสติก
  • ตัวดูดซับ (Sorbent): เฟสคงที่ที่ใช้
    • สิ่งที่ต้องคำนึงถึงคือ ชนิดของสารที่ต้องการแยก เทคนิคในการตรวจวัด ความหนาและความเสถียรของชั้นที่เคลือบ และชนิดของเฟสเคลื่อนที่
  • ตัวยึด (Binder) – เพิ่มความแข็งแรงของการยึดติดเฟสคงที่กับแผ่นเรียบ (มีหรือไม่มีก็ได้)
  • Fluorescent indicator - ช่วยการตรวจหาสารหลังการแยก (มีหรือไม่มีก็ได้)
sorbents
ตัวดูดซับ (Sorbents)

ชนิด Polar Inorganic

  • ลำดับการเคลื่อนที่ของสาร (elution) จะขึ้นอยู่กับ polarity/polarizability ของหมู่ functional groups ของสารเป็นหลัก
  • สามารถเลือกใช้ตัวเฟสเคลื่อนที่ได้หลายชนิดเพราะมีความเสถียรสูง
  • ข้อเสีย:
    • มี selectivity ที่ต่ำในการแยกสารบางกลุ่ม เช่น การแยกสารที่ใน homologues series
    • สารตัวอย่างที่มีความมีขั้วสูงอาจยึดกับตัวดูดซับได้แข็งแรงเกินไป ทำให้ยากต่อการชะสาร (ทำให้สารเคลื่อนที่)

ชนิด Non-polar Bonded Phases

  • A reversed-phase system
  • ข้อดี:
    • เป็นการ screening เพื่อเป็นแนวทางสำหรับการแยกโดยคอลัมน์โครมาโทกราฟีได้
    • เมื่อเปลี่ยนองค์ประกอบหรือสัดส่วนของเฟสเคลื่อนที่ มีผลต่อค่าการแยก (Rf) และรูปร่างของจุดสารที่ได้จากการแยกมาก
    • มีความถูกต้องของการทำซ้ำ (reproducibility) ที่ดี
sorbent tlc
ตัวดูดซับ (Sorbent) ที่ใช้ใน TLC

Mostly use

Limited use

Reverse phase mode

binders florescent indicators
ตัวยึด (Binders) และ Florescent Indicators
  • ไม่จำเป็นต้องมี
  • ตัวยึดที่นิยมใช้ เช่น Calcium sulfate (gypsum), Silicon dioxide, แป้ง หรือ polyesters
    • ข้อดีของการมีตัวยึด: ช่วยเพิ่มความแข็งแรง ความคงทน และการแตกร้าวของชั้นเคลือบของเฟสคงที่
    • ข้อเสียของการมีตัวยึด: ส่งผลต่อพฤติกรรมการดูดซับสารของเฟสคงที่ และลักษณะการแยกสารเมื่อใช้ support ที่แตกต่างกัน
  • Florescent Indicators ช่วยให้มองเห็นสารที่ไม่มีสีในแผ่นเรียบหลังการแยก (visualization) โดยอินดิเคเตอร์ที่นิยมใช้มี 2 แบบ Short-wave UV light (254 nm) และ Long-wave UV light (366 nm)
florescent indicators
Florescent Indicators
  • Long-wave UV light (366 nm): สารจะเห็นเป็นจุดสีสว่างซึ่งเกิดได้หลายสี บนพื้นที่มืดของแผ่น TLC เมื่อทำการส่องด้วยแสงยูวี
  • Short-wave UV light (254 nm): สารจะเห็นเป็นจุดสีดำบนพื้น fluorescence สีเขียวสว่างของแผ่น TLC เมื่อทำการส่องด้วยแสงยูวี
planar chromatography13
เฟสเคลื่อนที่ใน Planar Chromatography
  • ตัวทำละลายที่ดีในการทำ Planar Chromatography
    • มีความบริสุทธิ์สูง ไม่ทำปฏิกิริยากับสารและชั้นของเฟสคงที่ มีจุดเดือดต่ำ (เพื่อสะดวกขั้นตอนการทำให้แห้ง) มีความสามารถในการรวมกันได้ (miscibility) ในกรณีที่ใช้ตัวทำละลายผสม ไม่ไวไฟและไม่เป็นพิษ
  • เฟสเคลื่อนที่ในระบบ Normal phase (Non-polar MP with a polar SP)
    • ใช้ตัวทำละลายที่ไม่มีขั้วซึ่งอาจเติม polar modifier เพื่อช่วยควบคุมความแรงของการชะและ selectivity ของการแยก
    • การเพิ่ม polarity ของตัวทำละลาย จะทำให้ความแรงในการชะของเฟสเคลื่อนที่สูงขึ้น ส่งผลให้ค่า Rfมากขึ้น
  • เฟสเคลื่อนที่ในระบบ Reversed phase (Polar MP with a non-polar SP)
    • นิยมใช้สารละลายผสมของน้ำกับ organic modifier เช่น methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran
    • ความสามารถในการชะเพิ่มขึ้นเมื่อเพิ่มความเข้มข้นของ organic modifier หรือลด polarity ของ organic modifier
solvent optimization
หลักการหาเฟสเคลื่อนที่ (Solvent Optimization)
  • จากข้อมูลที่มีการตีพิมพ์
  • การลองผิดลองถูก (trial-and-error)
    • โดยใช้ประสบการณ์ที่เคยทำมา
    • ใช้ข้อมูลความแรงของตัวทำละลาย
  • จากการทำ Model หรือการคาดคะเนทางทฤษฏี
slide16
การเตรียมแผ่น
  • ใน PC: ใช้กระดาษกรองซึ่งเป็นพวกเซลลูโลส
    • กระดาษกรองที่ใช้จะต้องเก็บในที่ที่มีการควบคุมความชื้น เนื่องจากปริมาณน้ำในเซลลูโลสจะเป็นตัวกำหนดลักษณะการแยกของกระดาษกรอง
  • ใน TLC: เคลือบของแข็งของเฟสคงที่กับแผ่นเรียบ เช่น กระจก อะลูมิเนียมหรือแผ่นพลาสติก
    • การเคลือบของแข็งของเฟสคงที่กับแผ่นจะต้องเรียบ (smooth) และสม่ำเสมอ (uniform layer)
    • การเคลือบทำโดยนำเฟสคงที่ใส่น้ำหรือตัวทำละลายให้เป็น slurry แล้วนำไปเคลือบบนแผ่น หลังจากนั้นทำให้แห้งในอากาศ แล้วนำไปอบให้แห้งอีกครั้ง
    • การเคลือบแผ่นเรียบทำได้หลายวิธี โดยที่นิยมทำมากที่สุด คือ การแผ่กระจาย (Spreading) ซึ่งมีวิธีการที่ง่าย ไม่ยุ่งยาก
spreading technique
Spreading Technique
  • ความถูกต้องของการทำซ้ำ (reproducibility) ดีและสามารถปรับความหนาของชั้นที่เคลือบได้ง่าย
  • ขั้นตอนในการเคลือบ
    • เช็ดแผ่นที่เป็นตัว support ให้สะอาด
    • ทำการกระจายชั้นของเฟสคงที่โดยใช้แท่งแก้วค่อยปาดเกลี่ยหรือใช้เครื่องสำหรับการทำให้กระจายตัว (spreading apparatus)
    • ทำแผ่นที่เคลือบให้แห้งโดยตั้งให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง แล้วทำการอบให้แห้งอีกครั้งประมาณ 15-18 ชั่วโมง

Plate coater

precoated
ตัวอย่างคำนำหน้าที่ใช้บอกชนิดของเฟสคงที่ในแผ่นแบบ Precoated

J.C. Touchstone, Practice of Thin Layer Chromatography, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1992.

sample application
Sample Application
  • การใส่สารบนแผ่นควรทำให้มีขนาดเล็กๆ
  • การใส่สารสามารถทำเป็นจุด (spot) หรือ เป็นแถบ (streak) ก็ได้
  • สามารถเพิ่มปริมาณของสารที่บรรจุ โดยยังทำให้จุดหรือแถบมีขนาดเล็ก ได้โดยการทำซ้ำหลายๆ ครั้ง โดยแต่ละครั้งต้องทำให้ตัวทำละลายระเหยออกหมดก่อน
  • การเลือกวิธี sample application ขึ้นอยู่กับ
    • ปริมาตรของสารตังอย่าง
    • จำนวนตัวอย่างที่ต้องการทำต่อครั้ง
    • ความเที่ยงและการทำอัตโนมัติ
slide20
อุปกรณ์การบรรจุสาร
  • ทำด้วยตนเอง
    • Capillary tube
    • Micropipette
    • Syringe
  • เครื่องอัตโนมัติ
    • Auto spotter/Auto streaker
linear development
การแยกโดย Linear Development
  • การแยกเกิดขึ้นภายในภาชนะที่มีฝาปิดมิดชิด โดยแผ่นเรียบหรือกระดาษจะถูกวางไว้ในแนวเดียวกับการไหลของเฟสเคลื่อนที่
  • การเคลื่อนที่ของเฟสเคลื่อนที่มี 2 แบบ คือ
    • เคลื่อนที่ขึ้นตามแนวของแผ่นเรียบหรือกระดาษ (ascenting)
    • เคลื่อนที่ลงตามแนวของแผ่นเรียบหรือกระดาษ (decending)

Ascenting development

multiple development
การแยกโดย Multiple Development
  • ทำการ develop ซ้ำหลายๆ รอบ
  • เป็นการเพิ่มประสิทธิภาพของการแยก แต่จะเสียเวลาเพิ่มมากขึ้น
  • การทำ multiple development สามารถทำได้โดย
    • ทำซ้ำโดยใช้ระบบเฟสเคลื่อนที่เหมือนเดิมในทิศทางเดิม: ทำให้การแยกสารที่มีค่า Rfใกล้ๆ กัน แยกได้ดีขึ้น
    • ทำซ้ำโดยใช้ระบบเฟสเคลื่อนที่ใหม่ในทิศทางการแยกเดิม: ช่วยในการแยกสารที่มีความแตกต่างของ polarity มากๆ
    • การ development แบบ 2 มิติ: ทำการ developed ครั้งที่ 2 โดยเฟสเคลื่อนที่ที่แตกต่างกัน ในทิศทางที่ตั้งฉากกับทิศทางเดิม
detection
การตรวจวัด (Detection)
  • วิธีการตรวจวัดทางกายภาพ
    • การตรวจวัดโดยตรง: สำหรับสารที่มีสี
    • ภายใต้แสงยูวี
      • Fluorescent analyte
      • Plate with indicator
  • วิธีการตรวจวัดทางเคมี
    • ให้สารทำปฏิกิริยาทางเคมีเพื่อให้เกิดสารที่มีสีหรือ fluorescent spots โดยการพ่น (spraying) หรือ จุ่ม (dipping) กับรีเอเจนต์
    • ชนิดของ reagents ที่ใช้
      • สารก่อให้เกิดอนุพันธ์ (Derivatization)
      • Reversible color reaction เช่นไอของไอโอดีน, water spray, pH อินดิเคเตอร์
      • การทำให้สารอินทรีย์เกิดเป็นสีดำ (Charring) ด้วยกรดซัลฟูริกเข้มข้น
      • Reagents เฉพาะ
slide25
อุปกรณ์สำหรับการทำ TLC

ถังสำหรับดำเนินการแยก (Developing)

กล่องส่อง UV

แผ่นช่วยการอิ่มตัว

ชุดพ่นสารตรวจวัด (Reagent Sprayer)

แผ่น TLC

ชุดอุปกรณ์การใส่สารบนแผ่นเรียบ

planar chromatography26
การวิเคราะห์ด้วย Planar Chromatography

การทำคุณภาพวิเคราะห์

  • เทียบค่า Rf ของสารตัวอย่างกับสารมาตรฐานโดยใช้ภาวะในการแยกที่มีเหมือนกัน
  • นิยมทำสารมาตรฐานควบคู่ไปกับสารตัวอย่างบนแผ่นเดียวกันเลย

การทำปริมาณวิเคราะห์

  • หาปริมาณสารโดยการวัดโดยตรงจากจุดที่แยกได้บนแผ่น หรือนำสารออกมาแล้วค่อยทำการวัดด้วยวิธีการอื่นๆ ก็ได้
  • การทำปริมาณวิเคราะห์โดยตรงจากแผ่น (In situ)
    • เปรียบเทียบพื้นที่ของจุด (visual evaluation) ระหว่างสารตัวอย่างกับสารมาตรฐานที่ทราบปริมาณแน่นอนแล้ว
    • เปรียบเทียบค่าความเข้มของแสง (optical scanners) ระหว่างสารตัวอย่างกับสารมาตรฐานที่ทราบปริมาณแน่นอนแล้ว จากการสะท้อนแสงหรือฟลูออเรสเซนต์หรือการดูดกลืนแสง ด้วยเครื่อง scanning densitometer
  • การทำปริมาณวิเคราะห์โดยเอาสารออกจากแผ่น (Elution technique)
    • ขูดจุดของสารที่แยกออกมาจากแผ่น (จะมี sorbent ติดออกมาด้วย) แล้วทำการสกัดออกมาเพื่อทำการวิเคราะหืต่อไป
quantitative analysis
Quantitative Analysis
  • Elution technique
    • Scarping of the spots and eluting the substance from the sorbent
  • In situ visual evaluation
    • Comparing the spot sizes between sample and standards
  • In situ optical scanners
    • Scanning densitometers
    • Imaging scanners