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LAMP 的优点

LAMP 的优点. 操作简单 ，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT - LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 快速高效 ，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成 。 高特异性 ，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 高灵敏度 ，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。. LAMP 的缺点.

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Presentation Transcript

  1. LAMP的优点 • 操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 • 快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成。 • 高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 • 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。

  2. LAMP的缺点 • 由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。 • 由于灵敏度高。极易污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作。 • 在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。 • 引物设计复杂。

  3. 依赖于核酸序列的扩增 • 依赖于核酸序列的扩增（nucleic-acid sequence-based amplification, NASBA)是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术。 • 由加拿大Can-gene公司1991年首先发明。 • 主要用于RNA检测，具有高度敏感性和特异性。

  4. NASBA技术原理 • NASBA技术是由2个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核酸序列的酶促反应。 • 反应主要依赖于AMV逆转录酶、RNase H、T7 RNA聚合酶和2个特殊设计的引物。 • 其中引物1长度为45个碱基左右，3’端约20个碱基与靶序列互补，5’端具有被T7 RNA聚合酶识别的启动子序列；引物2长约20个碱基，5’端与靶序列RNA相同。

  5. NASBA扩增过程 NASBA反应分为2个作用相：非循环相和循环相。 非循环相：引物1与模板RNA结合，经AMV逆转录合成一条cDNA，形成DNA-RNA杂合体，RNase H将杂合体中的RNA降解。引物2再与单链DNA结合，AMV催化合成双链DNA。引物1带有T7 RNA聚合酶的识别位点，T7 RNA聚合酶以DNA链为模板合成RNA。然后由此进入循环相。

  6. 产物检测 • 电泳分析 • 杂交技术 • 电化学发光

  7. NASBA技术的优点 • 等温扩增 • 快速高效 • 特异性高 • 灵敏度高 • 设备简单

  8. NASBA的缺点 • 扩增长度受到限制 最适长度一般为100—250bp • 随着检测技术的发展扩增产物对检测技术提出了更高的要求。 • 酶不耐热。 • 扩增产物是单链ＲＮＡ，后续操作较复杂．

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